一种干燥综合征肾损害小鼠模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种干燥综合征肾损害小鼠模型的构建方法及其应用，本发明专利技术首次发现只采用小鼠肾小管抗原和佐剂免疫小鼠的方法即可构建得到同时表现为干燥综合征和肾损害的小鼠模型，所述方法不仅具有高效、快速、经济的优点，而且极易推广并广泛适用，具有很好的应用价值。价值。价值。

Construction and application of a mouse model of Sjogren's syndrome with renal damage

【技术实现步骤摘要】
一种干燥综合征肾损害小鼠模型的构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体地，本专利技术涉及一种干燥综合征肾损害小鼠模型的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]干燥综合征(Sjogren Syndrome，SS)是一种主要累及外分泌腺体的慢性炎症性自身免疫性疾病，干燥综合征根据发病原因可分为原发性干燥综合征(primary Sjogren Syndrome，pSS)和继发性干燥综合征(secondary Sjogren Syndrome，sSS)两种，随着疾病的进展，pSS可造成多器官、多系统受累。pSS的患病率约为0.1％
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1％，仅次于类风湿关节炎，居第二位，男女比例为1:9，目前其发病机制仍不明确，pSS被认为是一个起源于遗传因素与能够触发异常自身免疫应答的外源性因素之间的相互作用而发病的多因素致病过程。在特定表观遗传因素、遗传易感性和激素调节的作用下，触发外分泌腺上皮细胞(SGEC)功能失调，在pSS的发病中至关重要，是T淋巴细胞、B细胞过活跃和自身抗体产生的基础。除涎腺、腮腺、泪腺等外分泌腺以外，pSS还可累及皮肤、关节、肺、肾、心脏、血管等多种器官以及周围神经系统。肾间质损害是pSS肾损伤中最常见的病理类型，其次为肾小球肾炎。干燥综合征肾损害非常隐匿，临床症状不突出，只有约4.2％的患者有明显肾脏损害的临床表现，可见对干燥综合征肾损害的发病病因和病理机制的研究至关重要。
[0003]干燥综合征肾损害不仅起病隐蔽病程长，而且发病的病因和病理机制尚无明确的定论，所以对该病的研究就显得异常的迫切。建立动物模型并利用动物疾病模型来研究人类疾病，可以克服平时一些不易见到，而且不便于在病人身上进行实验的各种人类疾病的研究。同时还可克服人类疾病发生发展缓慢、潜伏期长、发病原因多样、经常伴有各种其它疾病等因素的干扰，可以用单一的病因，在短时间内复制出典型的动物疾病模型，对于研究人类各种疾病的发生、发展规律和防治疾病疗效的机理等是极为重要的手段和工具。实验动物是生物医学研究中不可或缺的工具，实验动物在探究基因基础功能、探寻疾病的发病机制以及应用药物的临床前筛选等方面都有着十分重要的作用。小鼠在发育和代谢上与人类具有极大的相似性，其基因与人类基因也具有极高的相似度(小鼠99％的基因能在人类基因组中找到同源基因)，且其生命周期短，被认为是哺乳动物中理想的模式生物。随着生物医学研究的不断发展，目前本领域仍缺乏干燥综合征肾损害相关的动物疾病模型，因此，提供一种成模率高、造模时间短、操作简单的干燥综合征肾损害小鼠疾病模型的构建方法仍是本领域亟待解决的问题。

技术实现思路

[0004]为了弥补本领域存在的干燥综合征肾损害小鼠模型这一技术空白，本专利技术的目的在于提供一种干燥综合征肾损害小鼠模型的构建方法及其应用。
[0005]本专利技术的上述目的通过以下技术方案得以实现：
[0006]本专利技术的第一方面提供了一种干燥综合征肾损害小鼠模型的构建方法。
[0007]进一步，所述方法包括如下步骤：
[0008]对小鼠施用含有小鼠肾小管抗原和弗氏佐剂的乳化剂，得到干燥综合征肾损害小鼠模型。
[0009]进一步，所述小鼠为C57BL/6小鼠；
[0010]优选地，所述C57BL/6小鼠为雌性C57BL/6小鼠；
[0011]更优选地，所述雌性C57BL/6小鼠为8周龄的雌性C57BL/6小鼠。
[0012]进一步，所述含有小鼠肾小管抗原和弗氏佐剂的乳化剂的施用方式包括皮下注射、静脉注射、腹腔注射或肌肉注射；
[0013]优选地，所述含有小鼠肾小管抗原和弗氏佐剂的乳化剂的施用方式为皮下注射。
[0014]在本专利技术的具体实施例中，所述含有小鼠肾小管抗原和弗氏佐剂的乳化剂的施用方式为皮下注射，皮下注射刺激免疫系统产生的应答显著强于其他途径。
[0015]进一步，所述小鼠肾小管抗原的制备包括如下步骤：
[0016]取小鼠的肾脏组织，加入消化酶进行消化，过滤制得悬液，对悬液进行离心取上清，制得小鼠肾小管抗原溶液；
[0017]优选地，所述小鼠为C57BL/6小鼠；
[0018]更优选地，所述C57BL/6小鼠为雌性C57BL/6小鼠；
[0019]最优选地，所述雌性C57BL/6小鼠为8周龄的雌性C57BL/6小鼠；
[0020]优选地，所述消化酶为胶原酶Ⅳ。
[0021]进一步，在本专利技术的具体实施方式中，所述小鼠肾小管抗原的制备包括如下步骤：按需要取C57BL/6小鼠，脱颈椎处死，75％酒精消毒，无菌条件下取出双侧肾脏，剥离包膜及结缔组织，用PBS洗净后放入无菌青霉素小瓶中，按照每个肾脏加入0.5mL PBS的量，向无菌青霉素小瓶中加入PBS，将瓶内的肾脏剪碎并转移到2mL细胞冻存管中，加入1.25mg/mL的胶原酶Ⅳ2mL于37℃的条件下消化1小时，每15分钟吹打一次使其消化更均匀，先后使用70μm和40μm的筛网进行过滤去除未消化组织以及肾小球，得悬液。在冰浴中将悬液充分匀浆，3000r、20min、4℃的条件离心，取上清液，采用BCA蛋白定量法定量肾脏抗原浓度，用PBS将肾小管抗原浓度调整至2mg/mL(或1mg/mL)。
[0022]进一步，所述BCA蛋白定量法是本领域技术人员常用的一种蛋白定量的方法。BCA(bicinchoninic acid，二喹啉甲酸)是一种稳定的水溶性复合物，在碱性条件下，二价铜离子可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子可以和BCA相互作用，两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的络合物，该复合物为水溶性的，在562nm处显示强吸光性，在一定浓度范围内，吸光度与蛋白质含量呈良好的线性关系，制作标准曲线，因此，可以根据待测蛋白在562nm处的吸光度计算待测蛋白的浓度。
[0023]进一步，所述弗氏佐剂包括FCA弗氏完全佐剂或FIA弗氏不完全佐剂。
[0024]进一步，所述弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂，分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。不完全弗氏佐剂(FIA)是液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为1
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5：1，可根据需要而定，通常为2：1。不完全佐剂中加卡介苗(最终浓度为2
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20mg/mL)或死的结核分枝杆菌，即得完全弗氏佐剂(FCA)。一般首次注射时用1/2体积FCA加上1/2体积的抗原进行乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。如不加佐剂，则抗原量增大10
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20倍。在免疫动物前，先将弗氏佐剂与抗原按一定比例混合，佐剂和抗原体积比一般为1：1，制备
成“油包水”乳状液。因为含SDS很易促使其乳化成油包水抗原乳化复合物，注射入动物体内时一定要保持乳化状态。
[0025]进一步，所述佐剂与抗原乳化的方法包括但不限于如下方法：
[0026](1)研磨法：先将佐剂加热并取适量放入无菌的玻璃研钵内，待冷却后再缓缓滴入等体积的抗原溶液，边滴边按同一方向研磨，滴本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种干燥综合征肾损害小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：对小鼠施用含有小鼠肾小管抗原和弗氏佐剂的乳化剂，得到干燥综合征肾损害小鼠模型。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述小鼠为C57BL/6小鼠；优选地，所述C57BL/6小鼠为雌性C57BL/6小鼠；更优选地，所述雌性C57BL/6小鼠为8周龄的雌性C57BL/6小鼠。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述含有小鼠肾小管抗原和弗氏佐剂的乳化剂的施用方式包括皮下注射、静脉注射、腹腔注射或肌肉注射；优选地，所述含有小鼠肾小管抗原和弗氏佐剂的乳化剂的施用方式为皮下注射。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述小鼠肾小管抗原的制备包括如下步骤：取小鼠的肾脏组织，加入消化酶进行消化，过滤制得悬液，对悬液进行离心取上清，制得小鼠肾小管抗原溶液；优选地，所述小鼠为C57BL/6小鼠；更优选地，所述C57BL/6小鼠为雌性C57BL/6小鼠；最优选地，所述雌性C57BL/6小鼠为8周龄的雌性C57BL/6小鼠；优选地，所述消化酶为胶原酶Ⅳ。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述弗氏佐剂包括FCA弗氏完全佐剂或FIA弗氏不完全佐剂。6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述含有小鼠肾小管抗原和弗氏佐剂的乳化剂的制备包括如...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈丽萌，马田田，施潇潇，陈华，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：