用于使蛋白质多聚化的变体结构域及其分离制造技术

本发明专利技术涉及用于产生且分离包括第免疫球蛋白多肽和第二免疫球蛋白多肽的免疫球蛋白蛋白质的手段和方法，尤其关于用于产生且分离包括所述第免疫球蛋白多肽和第二免疫球蛋白多肽的蛋白质的手段和方法。通过包括来自产生所需免疫球蛋白蛋白质的细胞的氨基酸变体及变体分离结构域，可将如所产生的所需免疫球蛋白蛋白质与免疫球蛋白蛋白质混合物分离。白蛋白质与免疫球蛋白蛋白质混合物分离。

Variant domains used to polymerize proteins and their separation

【技术实现步骤摘要】
用于使蛋白质多聚化的变体结构域及其分离
[0001]本申请是申请日为2020年05月08日的PCT国际专利申请PCT/NL2020/050298进入中国国家阶段的中国专利申请号202080048983.X、专利技术名称为“用于使蛋白质多聚化的变体结构域及其分离”的分案申请。
[0002]引言
[0003]过去数十年的一类重要治疗性分子已为单株抗体类。单株抗体已成功地治疗包括癌症的各种疾病。在过去十年间，已发现靶向超过一个抗原决定基，例如肿瘤细胞上的超过一个抗原决定基也可为有效的。可给予患者单独地研发的单株抗体的组合以及来自一个细胞的单株抗体的组合。此类细胞可产生形成出于靶向一或多种细胞类型上的超过一个目标的目的而研发的抗体混合物的一部分的具有二种或更多种不同特异性的抗体。当两个抗体在一个细胞中表现时，可产生包括包括双特异性抗体及单特异性抗体的各种抗体组合。
[0004]用于调适各种免疫球蛋白链的缔合的技术为可用的。已研发出各种二聚化结构域以有利于如此产生的细胞中的特定重链缔合。可使用共同轻链以避免同源重链及轻链的误配。在某些应用中，双特异性抗体可置换两个抗体的组合的使用。双特异性抗体也可用于使个体中例如肿瘤细胞及免疫细胞(例如T细胞)的两个细胞合在一起。其实施例为癌细胞上所存在的CD3及抗原决定基的组合靶向。类似地，已出现能够结合相同或不同抗原或抗原决定基中的三个或更多个的多价多聚体或多特异性抗体。两个抗体的组合表示结合至相同或不同目标上的不同抗原决定基的两个不同免疫球蛋白的混合物，但在双特异性抗体中此系经由单个免疫球蛋白达成。在多特异性多聚体或多特异性抗体中，可靶向相同或不同抗原上的三个或更多个不同抗原决定基。
[0005]通过结合至相同或不同目标上的两个抗原决定基，双特异性抗体可具有相较于结合至相同抗原决定基的两个抗体的组合而言类似或优良的作用。此种情况还应用于能够结合三个或更多个目标的多特异性多聚体。双特异性或多特异性免疫球蛋白蛋白质可集结细胞上的两个或更多个表面蛋白或可使免疫效应细胞接近异常细胞，在任一情况下均造成细胞凋亡。此外，组合单个分子中两个不同结合区的经分离双特异性抗体还展示相对于靶向同两个不同目标的两个抗体的混合物而言的有利作用。自技术及监管视角看，单个双特异性抗体或多特异性多聚体或抗体的研发可不太复杂，此系因为制造、临床前及临床测试涉及单个分子。因此，基于双特异性抗体或多特异性多聚体/抗体的疗法可通过不太复杂且具成本效益、同时附随地具有提供更有效疗法的潜能的药物研发方法来促进。
[0006]诸如基于IgG格式的双特异性抗体的双特异性抗体已通过各种方法产生。例如，双特异性抗体可通过使用重组DNA技术在单个细胞中表现具有两个抗体的组分来产生。在一些实施方案中，如本文先前所陈述，这些方法可产生多个抗体物种，例如其中两个不同重链及两个不同轻链系由细胞产生。除非经特定地调适，否则重链通常可与由细胞产生的任何轻链配对，如果此类对不为正确同源对，则通常产生非功能性结合位点。在以上实施例中，一个该重链可能与任一轻链配对。
[0007]除非经特定地调适，否则重链通常可与由细胞产生的任何其他重链配对。在未经调适环境中，至多十个不同免疫球蛋白分子可由细胞产生。抗体混合物的复杂度及非功能
性重链及轻链组合的存在可通过选择共享共同轻链的重链
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轻链组合来解决。此还应用于多特异性多聚体或抗体的产生及使用重组DNA技术将三个或更多个可变结构域并入单个抗体中的情形。
[0008]当使用共同轻链以及表现两个或更多个含有通过单个生产细胞驱动不同重链的特定异源二聚化的修饰的重链时，仍可产生具有同一结合结构域的成对重链的一些同源二聚体，从而产生单特异性抗体及双特异性抗体的混合物。此种情况还适用于使用共同轻链以及表现两个或更多个重链，且此类重链中的一者或多者含有两个或更多个重链可变区，以使得单个生产细胞可产生多特异性多聚体或抗体及附加同源二聚体时。在需要特定同源二聚体的情况下，可产生一些异源二聚体。因此，在产生蛋白质的混合物的各情况下，可能需要将一个或多个所需二聚体与所得混合物分离。因此，在此项技术中需要用于产生且分离单特异性抗体或双特异性抗体或多价抗体或多聚体的改良技术和/或替代性技术。
[0009]利用抗体或其片段的电荷和/或等电点(pI)或利用经由电荷层析法产生的所需蛋白质物种的等电聚焦或所得独特峰的各种分离方法为可用的。本文揭露促进与混合物的分离的新型产物以及用于分离此类产物的新型方法。
[0010]实施方案
[0011]在本文提及带电氨基酸的情况下，其是指在生理学相关pH下，包括例如在活体内条件下的电荷。
[0012]在一个实施方案中，本专利技术提供免疫球蛋白区，优选地相较于原始免疫球蛋白区(优选地原始CH1区且更优选地人类野生型CH1区)而言包括氨基酸的变体的CH1区，其中原始氨基酸在原始免疫球蛋白区中未经表面暴露，其中变体选自
[0013]‑
中性氨基酸变带负电氨基酸；
[0014]‑
带正电氨基酸变中性氨基酸；
[0015]‑
带正电氨基酸变带负电氨基酸；
[0016]‑
中性氨基酸变带正电氨基酸；
[0017]‑
带负电氨基酸变中性氨基酸；以及
[0018]‑
带负电氨基酸变带正电氨基酸。
[0019]在一个实施方案中，本专利技术提供免疫球蛋白区，优选地相较于原始该免疫球蛋白区(优选地原始CH1区、CH2区或CH3区且更优选地人类野生型CH1区、CH2区或CH3区)而言包括在免疫球蛋白中未经表面暴露的氨基酸的变体的免疫球蛋白CH1区、CH2区、CH3区或此类区的组合，其中变体选自
[0020]‑
中性氨基酸变带负电氨基酸；
[0021]‑
带正电氨基酸变中性氨基酸；
[0022]‑
带正电氨基酸变带负电氨基酸；
[0023]‑
中性氨基酸变带正电氨基酸；
[0024]‑
带负电氨基酸变中性氨基酸；以及
[0025]‑
带负电氨基酸变带正电氨基酸。
[0026]相较于人类野生型CH1区而言，本专利技术的免疫球蛋白CH1区优选包括一个或多个未经表面暴露的氨基酸或优选地内埋式氨基酸的一个或多个变体，该一个或多个变体选自由以下组成的群：
[0027]‑
中性氨基酸变带负电氨基酸的变体；
[0028]‑
带正电氨基酸变中性氨基酸的变体；
[0029]‑
中性氨基酸变带正电氨基酸的变体；以及
[0030]‑
带负电氨基酸变中性氨基酸的变体。
[0031]本专利技术还提供相较于人类野生型CH1区而言包括在选自N159、N201、T120、K147、D148、Y149、V154、A172、Q175、S190以及K213的位置(EU编号)处的氨基酸的变体的免疫球蛋白CH1区。氨基酸的变体优选处于来自D148、Y149、V154、N1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种免疫球蛋白CH1、CH2、CH3区或所述区的组合，所述区包括在免疫球蛋白中未经表面暴露的氨基酸的变体，其中所述变体选自
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中性氨基酸变带负电氨基酸；
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带正电氨基酸变中性氨基酸；
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带正电氨基酸变带负电氨基酸；
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中性氨基酸变带正电氨基酸；
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带负电氨基酸变中性氨基酸；以及
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带负电氨基酸变带正电氨基酸。2.根据权利要求1所述的免疫球蛋白区，其包括在免疫球蛋白中未经表面暴露的氨基酸的两个或更多个变体。3.根据权利要求1或权利要求2所述的免疫球蛋白区，其中所述氨基酸的变体不处于CH1/CL、CH2/CH2结构域或CH3/CH3结构域界面中。4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫球蛋白区，其为IgG区，优选为IgG1区。5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫球蛋白区，其中所述未经表面暴露的氨基酸为内埋式的。6.一种免疫球蛋白CH1区，其包括选自以下的氨基酸的变体：N159、N201、T120、K147、D148、Y149、V154、A172、Q175、S190以及K213(EU编号)。7.根据权利要求5所述的免疫球蛋白CH1区，其包括选自以下的氨基酸的变体：D148、Y149、V154、N159、A172、S190以及N201。8.根据权利要求6或权利要求7所述的免疫球蛋白CH1区，其包括选自N159和/或N201的氨基酸的变体。9.根据权利要求1至8中任一项所述的免疫球蛋白CH1区，其包括所述氨基酸的两个或更多个变体。10.根据权利要求9所述的免疫球蛋白CH1区，其中所述两个或更多个变体包括以下中的两者或更多者：
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中性氨基酸变带负电氨基酸；
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带正电氨基酸变中性氨基酸；
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带正电氨基酸变带负电氨基酸；或以下中的两者或更多者：
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中性氨基酸变带正电氨基酸；
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带负电氨基酸变中性氨基酸；以及
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带负电氨基酸变带正电氨基酸。11.根据权利要求9或权利要求10所述的免疫球蛋白CH1区，其包括选自以下的组的氨基酸的变体：A172/S190/N201、T197/K213、D148/Q175、N159/Q213、K147/Q175、Y149/V154/A172/S190、N201/K213、T120/N201、N201/N159、T120/N159、T120/N201/N159以及N201/K213/N159。12.一种免疫球蛋白CH2区，其包括氨基酸V303的变体。13.一种免疫球蛋白CH3区，其包括选自以下的氨基酸的变体：K370、E382以及E388，优选E388。
14.根据权利要求6至13所述的免疫球蛋白区，其中所述变体选自
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中性氨基酸变带负电氨基酸；
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带正电氨基酸变中性氨基酸；
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带正电氨基酸变带负电氨基酸；
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中性氨基酸变带正电氨基酸；
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带负电氨基酸变中性氨基酸；以及
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带负电氨基酸变带正电氨基酸。15.根据权利要求1至5所述的免疫球蛋白区，其包括根据权利要求6至14所述的免疫球蛋白区。16.一种免疫球蛋白CH1/CL结构域、CH2结构域或CH3结构域，其包括根据权利要求1至15所述的免疫球蛋白区。17.根据权利要求16所述的免疫球蛋白CH2结构域，其进一步包括Fc沉默突变。18.根据权利要求16所述的免疫球蛋白CH3结构域，其进一步包括CH3异源二聚化结构域，其优选包括于一个CH3区中的CH3变体L351D和L368E以及于另一CH3区上的CH3变体T366K和L351K。19.一种蛋白质，其包括根据权利要求16至18所述的免疫球蛋白结构域。20.一种抗体，优选地多特异性抗体，其包括根据权利要求16至19所述的免疫球蛋白结构域。21.根据权利要求20所述的多特异性抗体，其包括不同重链。22.根据权利要求20或21所述的抗体，其包括有包括选自以下的一个或多个变体的第一重链：
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中性氨基酸变带负电氨基酸；
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带正电氨基酸变中性氨基酸；
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带正电氨基酸变带负电氨基酸；以及不同于所述第一重链的包括选自以下的一个或多个变体的第二重链：
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中性氨基酸变带正电氨基酸；
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带负电氨基酸变中性氨基酸；以及
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带负电氨基酸变带正电氨基酸。23.根据权利要求20至22所述的多特异性抗体，其中所述重链包括可相容异源二聚化区。24.根据权利要求23所述的多特异性抗体，其包括可相容CH3异源二聚化区。25.根据权利要求21至24所述的多特异性抗体，其中所述重链中的一者包括CH3变体L351D和L368E，并且所述重链中的另一者包括CH3变体T366K和L351K。26.根据权利要求20至25中任一项所述的抗体，其包括第一重链和不同的第二重链，并且其中所述第一重链包括选自以下的一个或多个变体：
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中性氨基酸变带负电氨基酸；
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带正电氨基酸变中性氨基酸；以及
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带正电氨基酸变带负电氨基酸；并且其中所述第一重链进一步包括CH3变体L351D和L368E；并且所述第二重链包括CH3变体
T366K和L351K。27.根据权利要求20至26中任一项所述的抗体，其包括第一重链和不同的第二重链，并且其中所述第二重链包括选自以下的一个或多个变体：
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中性氨基酸变带正电氨基酸；
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带负电氨基酸变中性氨基酸；以及
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带负电氨基酸变带正电氨基酸；并且其中所述第一重链进一步包括CH3变体L351D和L368E；并且所述第二重链包括CH3变体T366K和L351K。28.根据1至19所述的免疫球蛋白区或结构域、根据权利要求20所述的蛋白质或根据权利要求21至27所述的抗体，其包括表14部分B的CH1区序列、CH2区序列和/或CH3区序列。29.根据1至18所述的免疫球蛋白区或结构域、根据权利要求19所述的蛋白质或根据权利要求20至27所述的抗体或根据权利要求28所述的免疫球蛋白区或结构域、蛋白质或抗体，其包括人类免疫球蛋白区，优选IgG区，优选IgG1区。30.根据权利要求20至29中任一项所述的抗体，其为IgG1抗体。31.根据权利要求20至30中任一项所述的抗体，其包括一个或多个抗体轻链。32.一种组合物，其包括根据1至31所述的免疫球蛋白区、免疫球蛋白结构域、蛋白质或抗体。33.一种药物组合物，其包括根据1至32所述的免疫球蛋白区、免疫球蛋白结构域、蛋白质或抗体且优选包括药学上可接受的赋形剂。34.一种核酸，其编码根据1至33所述的免疫球蛋白区、免疫球蛋白结构域、蛋白质或抗体。35.一种核酸，其编码根据权利要求20至31所述的抗体。36.一种重组宿主细胞，其包括根据权利要求34或权利要求35所述的核酸。37.一种产生根据权利要求20至31中任一项所述的抗体的方法，其中所述方法包括以下步骤：提供编码具有根据权利要求1至15中任一项所述的CH1、CH2、CH3区或其组合或根据权利要求16至18所述的结构域的第一重链的核酸；提供编码第二重链的核酸，其中所述第一重链和所述第二重链可为相同或不同的；提供编码轻链的核酸；将所述核酸引入宿主细胞中且培养所述宿主细胞以表达所述核酸；以及通过执行以下步骤中的至少一个来产生所述抗体：自宿主细胞培养物收集所述抗体，执行收获物澄清，执行蛋白质捕获，执行阴离子交换层析，以及执行阳离子交换层析以将所述抗体与另一抗体或抗体片段分离。38.一种产生根据权利要求20至31中任一项所述的抗体的方法，其中所述方法包括以下步骤：提供编码具有根据权利要求1至15中任一项所述的CH1、CH2、CH3区或其组合或根据权
利要求16至20所述的结构域的第一重链的核酸；提供编码第二重链的核酸，其中所述第一重链和所述第二重链可为相同或不同的；提供编码轻链的核酸；将所述核酸引入宿主细胞中且培养所述宿主细胞以表达所述核酸；以及自所述宿主细胞培养物收集所述抗体，以及在分离步骤中通过在凝胶上进行等电聚焦来将所述抗体与其他抗体或抗体片段分离。39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述第一重链和所述第二重链包括可相容异源二聚化区，优选可相容CH3异源二聚化区。40.一种用于产生多特异性抗体的方法，所述多特异性抗体包括等电点不同的第一重链和第二重链，其中所述方法包括以下步骤：提供编码所述第一重链的CH1、CH2、CH3区或其组合的核酸及编码所述第二重链的CH1、CH2、CH3区或其组合的核酸，使得第一经编码重链的等电点与第二经编码重链的等电点不同，其中所述CH1区中的至少一者包括在选自N159、N201、T120、K147、D148、Y149、V154、A172、Q175、S190以及K213(EU编号)的位置处的氨基酸变体或在位置V303(EU编号)处的CH2区氨基酸变体或在选自K370、E382以及E388(EU编号)的位置处的CH3区氨基酸变体或所述CH区氨基酸变体的组合，以及培养宿主细胞以表达所述核酸；以及利用等电点差异自宿主细胞培养物收集所述多特异性抗体，其进一步包括以下步骤：自所...

【专利技术属性】
技术研发人员：科内利斯，
申请(专利权)人：美勒斯公司，
类型：发明
国别省市：