25-羟基维生素D3抗原制备方法及免疫层析试纸条技术

本发明专利技术公开了一种25

【技术实现步骤摘要】
25
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羟基维生素D3抗原制备方法及免疫层析试纸条


[0001]本专利技术涉及抗原制备
，具体涉及一种25
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羟基维生素D3抗原制备方法及免疫层析试纸条。

技术介绍

[0002]维生素D是一种脂溶性类固醇激素前体，是调节机体钙磷代谢的重要激素，主要由人体皮肤经紫外线照射后合成，少部分可经饮食获得。维生素D是参与许多人体和动物体生物学过程的重要物质。维生素D的缺乏会导致严重的疾病，如骨质疏松和软骨病。过量的维生素D具有毒性，影响肠道钙吸收，引发高钙血症，还有高血压，胃肠问题等。通过测量或定量维生素D，即确定其浓度，可以确认潜在的缺陷或过量，做好疾病防控。
[0003]维生素D本身无生物活性，必须在肝脏和肾脏经过两步连续的羟基化过程成为有生物活性的1,25
‑
二羟基维生素D。维生素D的两个最重要的形式是维生素D3(胆钙化甾醇)和维生素D2(麦角钙化甾醇)，在人体内维生素D3和D2与血浆中维生素D结合蛋白结合，并转运到肝脏，两者经羟基化成为25
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羟基维生素D，25
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羟基维生素D的血清水平被认为是维生素D状态的主要指标，其中，25
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羟基维生素D3是人体血液中维生素D的主要循环形式，当体内缺乏时会引起一系列疾病。
[0004]由于维生素D的特殊分子结构，长时间以来都没有太好的检测方法，一般维生素D的检测花费时间较长，需要特殊的设备，目前用于测定25
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羟基维生素D3的方法有高效液相色谱法(HPLC)，放射免疫法(RIA)，电化学发光法和酶联免疫法等，临床实验室常用的检测方法有免疫荧光法等。
[0005]维生素D化学合成技术比较复杂，多数公司缺乏维生素D化学合成技术，或者合成的效率过低，这种策略得到的抗原，以及用这种抗原免疫得到的抗体，不能精准识别25
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羟基维生素D3。
[0006]用上述抗原或者制备的抗体，研发的25
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羟基维生素D3检测试剂盒，无论使用哪种技术(放射免疫法、酶联免疫法、化学发光法)，都不能得到与HPLC精确测试相媲美的结果。

技术实现思路

[0007]本专利技术要解决的技术问题是，提供一种25
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羟基维生素D3抗原制备方法，能够很好的将25
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羟基维生素D3小分子进行活化，与载体蛋白进行偶联反应，得到所述25
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羟基维生素D3抗原，免疫原性强，将其运用到免疫层析技术上，可以制备具有高灵敏度、高特异性、简单快捷和无需大型仪器设备的检测试纸条，可用于25
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羟基维生素D3的检测。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是，该25
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羟基维生素D3抗原制备方法，包括以下步骤：
[0009]S1：取25
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羟基维生素D3、载体蛋白KLH、EDC和NHS；其中，25
‑
羟基维生素D3和NHS分别用DMF充分溶解得到小分子溶液和NHS溶液，载体蛋白KLH用PBS溶解得到载体蛋白KLH溶液，EDC用CHCl3溶解得到EDC溶液；
[0010]S2：将所述步骤S1中的小分子溶液、EDC溶液和NHS溶液依次加入到混合容器中，避光、氮气保护下搅拌反应；
[0011]S3：向所述步骤S2中的反应液里加入乙酸乙酯溶液进行混合，然后加入和混合液相等体积的纯水再次混匀和静置，待溶液分层后将下层的水萃取出去；向萃取后的溶液里加入适量无水硫酸钠溶液把有机溶液中多余的水分吸收干燥；
[0012]S4：将所述步骤S3中含有小分子的有机溶液进行旋转蒸干，有机溶液蒸干后有固体析出在容器内壁上；
[0013]S5：向蒸干后的容器内加入DMF溶液充分溶解所述步骤S4中容器内壁上所有的干燥颗粒物，然后将容器内的DMF溶液缓慢滴加到载体蛋白KLH溶液内，边加边搅拌，加液完成后避光搅拌过夜放置；
[0014]S6：将所述步骤S5中过夜放置的溶液进行透析；得到25
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羟基维生素D3抗原。
[0015]上述技术方案中，对25
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羟基维生素D3小分子进行活化后，使其能够更好的与载体蛋白进行偶联反应；本专利技术的合成步骤简洁有效，得率高，完全可用于免疫分析中，为人们对25
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羟基维生素D3的免疫检测提供原料，所得25
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羟基维生素D3抗原具有免疫原性强，将其运用到免疫层析技术上，可以制备具有高灵敏度、高特异性、简单快捷和无需大型仪器设备的检测试剂条，可用于25
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羟基维生素D3的检测。
[0016]优选的，在所述步骤S3中，共进行三次萃取操作，加入和混合液相等体积的纯水再次混匀和静置，待溶液分层后将下层的水萃取出去，进行第一次萃取操作；第二次萃取重复第一次萃取操作；第三次萃取时，加入和混合液相等体积的饱和氯化钠溶液再次混匀和静置，待溶液分层后将下层的水萃取出去。
[0017]优选的，在所述步骤1中，投入的25
‑
羟基维生素D3、载体蛋白KLH、EDC和NHS的量为：25
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羟基维生素D35g，载体蛋白KLH2.5g，EDC和NHS各2.5g；其中，25
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羟基维生素D3和NHS分别用10mL DMF充分溶解，载体蛋白KLH用90mLPBS充分溶解，EDC用10mL CHCl3溶解。
[0018]优选的，在所述步骤S3中，向所述步骤S2中的反应液里加入150mL乙酸乙酯溶液进行混合。
[0019]优选的，在所述步骤S2中，搅拌反应的温度条件为25
±
5℃，搅拌反应时间为2小时。
[0020]优选的，在所述步骤S4中，旋转蒸干采用的是旋转蒸发仪进行，温度为45℃，旋转速度为30r/min。
[0021]优选的，在所述步骤S5中，向蒸干后的容器内加入DMF溶液的量为10mL；载体蛋白KLH溶液的量为90mL；加液完成后避光搅拌过夜放置，温度条件保持4℃。
[0022]优选的，在所述步骤S6中，透析是将溶液装入透析袋于透析液中透析48小时；透析液为0.05M、pH7.0的PBS。
[0023]本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种检测样本中25
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羟基维生素D3的免疫层析试纸条。
[0024]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是，该检测样本中25
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羟基维生素D3的免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和底板；所述硝酸纤维素膜包括有被前述本专利技术制备方法得到的25
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羟基维生素D3
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载体蛋白KLH抗原包被的检测线和被羊抗鸡抗体包被的质控线。
[0025]本专利技术的检测样本中25
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羟基维生素D3的免疫层析试纸条，包含前述的25
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羟本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种25
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羟基维生素D3抗原制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：取25
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羟基维生素D3、载体蛋白KLH、EDC和NHS；其中，25
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羟基维生素D3和NHS分别用DMF充分溶解得到小分子溶液和NHS溶液，载体蛋白KLH用PBS溶解得到载体蛋白KLH溶液，EDC用CHCl3溶解得到EDC溶液；S2：将所述步骤S1中的小分子溶液、EDC溶液和NHS溶液依次加入到混合容器中，避光、氮气保护下搅拌反应；S3：向所述步骤S2中的反应液里加入乙酸乙酯溶液进行混合，然后加入和混合液相等体积的纯水再次混匀和静置，待溶液分层后将下层的水萃取出去；向萃取后的溶液里加入适量无水硫酸钠溶液把有机溶液中多余的水分吸收干燥；S4：将所述步骤S3中含有小分子的有机溶液进行旋转蒸干，有机溶液蒸干后有固体析出在容器内壁上；S5：向蒸干后的容器内加入DMF溶液充分溶解所述步骤S4中容器内壁上所有的干燥颗粒物，然后将容器内的DMF溶液缓慢滴加到载体蛋白KLH溶液内，边加边搅拌，加液完成后避光搅拌过夜放置；S6：将所述步骤S5中过夜放置的溶液进行透析；得到25
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羟基维生素D3抗原。2.根据权利要求1所述的25
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羟基维生素D3抗原制备方法，其特征在于，在所述步骤S3中，共进行三次萃取操作，加入和混合液相等体积的纯水再次混匀和静置，待溶液分层后将下层的水萃取出去，进行第一次萃取操作；第二次萃取重复第一次萃取操作；第三次萃取时，加入和混合液相等体积的饱和氯化钠溶液再次混匀和静置，待溶液分层后将下层的水萃取出去。3.根据权利要求1或2所述的25
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羟基维生素D3抗原制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，投入的25
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羟基维生素D3、载体蛋白KLH、EDC和NHS的量为：25
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羟基维生素D35g，载体蛋白KLH2.5g，EDC和NHS各2.5g；其中，25
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羟基维生素D3和NHS分别用10mL DMF充分溶解，载体蛋白KLH用90mLPBS充分溶解，EDC用10mL CHCl3溶解。4.根据权利要求3所述的25
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羟基维生素D3抗原制备方法，其特征在于，在所述步骤S3中，向所述步骤S2中的反应液里加入150mL乙酸乙酯溶液进行混合。5.根据权利要求4所述的25
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羟基维生素D3抗原制备方法，其特征在于，在所述步骤S2中，搅拌反应的温度条件为25
±
5℃，搅拌反应时间为2小时。6.根据权利要求5所述的25
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羟基维生素D3抗原制备方法，其特征在于，在所述步骤S4中，旋转蒸干采用的是旋转蒸发仪进行，温度为45℃，旋转速度为30r/min。7.根据权利要求6所述的25
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【专利技术属性】
技术研发人员：许行尚，杰弗瑞，
申请(专利权)人：江苏华控生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：