一种猪瘟病毒的诊断方法技术

本发明专利技术公开了一种猪瘟病毒的诊断方法，包括如下步骤：1)样品制备；2)核酸提取；3)核酸扩增；4)核酸电泳检测；5)判断标准；6)引物设计。本发明专利技术属于猪瘟病毒诊断技术领域，具体是一种猪瘟病毒的诊断方法，特异性检测引物来建立猪瘟病毒RT

【技术实现步骤摘要】
一种猪瘟病毒的诊断方法


[0001]本专利技术属于猪瘟病毒诊断
，具体是指一种猪瘟病毒的诊断方法。

技术介绍

[0002]猪瘟病是由猪瘟病毒引起的一种猪的传染病，其典型特征为高热稽留和小血管壁变性引起广泛出血、梗塞和坏死等病变。猪瘟每年给养猪业都会造成巨大的经济损失。我国将其列为一类动物疫病。到目前为止，猪瘟已经存在了近2个世纪，虽然世纪各国对该病的防治都做了巨大努力，而且在北美、欧洲和北欧的一些地区还成功地消灭了猪瘟，但猪瘟在世界许多地区仍广泛传播，并且其流行和发病的特点已发生了很大变化，许多病例属于温和型和隐性感染、持续感染，症状不典型，这给猪瘟的快速准确临床诊断及有效地预防控制带来了难度，不能及时将病猪进行隔离或淘汰。

技术实现思路

[0003]针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本专利技术提供一种猪瘟病毒的诊断方法，特异性检测引物来建立猪瘟病毒RT
‑
PCR的检测方法，以降低检测成本。
[0004]本专利技术采取的技术方案如下：本专利技术一种猪瘟病毒的诊断方法，包括如下步骤：
[0005]1)样品制备：取疑似猪瘟的病料1g于4ML灭菌EP管中，并按1:4比例加入PBS溶液，向离心管中加入钢珠放置研磨仪器研磨成乳剂，反复冻融3次，8000r/min离心5分钟，取上清200μL进行核酸提取；
[0006]2)核酸提取：严格按天隆提取试剂盒说明书进行，先在第1列和第7列加入20微升蛋白酶K，后再加入阳性对照200微升、阴性对照200微升和样品200微升在对应的孔中，然后加上护套放置天隆提取仪器上提取，等待38min后在第6列和12列取出核酸放置1.5ML灭菌的离心管中，即为模板，即用或
‑
20℃冻存备用；
[0007]3)核酸扩增
[0008]①
配体系：严格按照宝生物一步法RT
‑
PCR检测试剂盒说明书进行，总体系25μL，其中2
×
1stepBuffer12.5μL，PrimeScript1StepEnzymeMix1μL，10uMCSFV上游引物0.8μL，10uMCSFV下游引物0.8μL，待检RNA摸板3μL；
[0009]②
RT
‑
PCR程序：50℃逆转录30min；94℃预变性2min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存；
[0010]4)核酸电泳检测：取5μLPCR产物，混合2μLloadingBuffer，1％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，以DNA分子量标准DL2000为参考；5)判断标准
[0011]①
猪瘟结果判定在阴性对照无目的条带、阳性对照有明显512bp条带的前提下，样品出现512bp大小条带定为CSFV核酸阳性，否则为阴性；
[0012]②
蓝耳结果判定在阴性对照无目的条带、阳性对照有明显508bp条带的前提下，样品出现508bp大小条带定为PRRSV核酸阳性，否则为阴性；
[0013]6)引物设计
[0014]①
根据猪瘟病毒(CSFV)的序列，设计一对猪瘟病毒特异性扩增引物，引物详细序列为：
[0015]CSFV上游引物：5
’‑
GTCACAGCACTTAATGTGGTC
‑3’
；
[0016]CSFV下游引物：5
’‑
CACTTACCTATGGGGTAGTGTG
‑3’
；
[0017]在猪瘟病毒核酸中特异性扩增目的片段大小为512bp；
[0018]②
根据蓝耳病毒(PRRSV)的序列，设计一对猪瘟病毒特异性扩增引物，引物详细序列为：
[0019]PRRSV上游引物：5
’‑
TGGGCGACAATGTCCCTAAC
‑3’
；
[0020]PRRSV下游引物：5
’‑
GCTGAGTATTTTGGGCGTGT
‑3’
；
[0021]在蓝耳病毒核酸中特异性扩增目的片段大小为508bp。
[0022]进一步地，步骤1)所述的病料为肾脏、淋巴结、脾脏和扁桃体。
[0023]采用上述结构本专利技术取得的有益效果如下：本方案一种猪瘟病毒的诊断方法，特异性检测引物来建立猪瘟病毒RT
‑
PCR的检测方法，以降低检测成本。
附图说明
[0024]图1为本专利技术猪瘟病毒的诊断方法的检测结果图。
[0025]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。
具体实施方式
[0026]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0027]如图1所示，本专利技术猪瘟病毒的诊断方法，包括如下步骤：
[0028]7)样品制备：取疑似猪瘟的病料1g于4ML灭菌EP管中，并按1:4比例加入PBS溶液，向离心管中加入钢珠放置研磨仪器研磨成乳剂，反复冻融3次，8000r/min离心5分钟，取上清200μL进行核酸提取；
[0029]8)核酸提取：严格按天隆提取试剂盒说明书进行，先在第1列和第7列加入20微升蛋白酶K，后再加入阳性对照200微升、阴性对照200微升和样品200微升在对应的孔中，然后加上护套放置天隆提取仪器上提取，等待38min后在第6列和12列取出核酸放置1.5ML灭菌的离心管中，即为模板，即用或
‑
20℃冻存备用；
[0030]9)核酸扩增
[0031]③
配体系：严格按照宝生物一步法RT
‑
PCR检测试剂盒说明书进行，总体系25μL，其中2
×
1stepBuffer12.5μL，PrimeScript1StepEnzymeMix1μL，10uMCSFV上游引物0.8μL，10uMCSFV下游引物0.8μL，待检RNA摸板3μL；
[0032]④
RT
‑
PCR程序：50℃逆转录30min；94℃预变性2min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存；
[0033]10)核酸电泳检测：取5μLPCR产物，混合2μLloadingBuffer，1％的琼脂糖凝胶电泳
分析PCR产物，以DNA分子量标准DL2000为参考；
[0034]11)判断标准
[0035]③
猪瘟结果判定在阴性对照无目的条带、阳性对照有明显512bp条带的前提下，样品出现512bp大小条带定为CS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪瘟病毒的诊断方法，其特征在于，包括如下步骤：1)样品制备：取疑似猪瘟的病料1g于4ML灭菌EP管中，并按1:4比例加入PBS溶液，向离心管中加入钢珠放置研磨仪器研磨成乳剂，反复冻融3次，8000r/min离心5分钟，取上清200μL进行核酸提取；2)核酸提取：严格按天隆提取试剂盒说明书进行，先在第1列和第7列加入20微升蛋白酶K，后再加入阳性对照200微升、阴性对照200微升和样品200微升在对应的孔中，然后加上护套放置天隆提取仪器上提取，等待38min后在第6列和12列取出核酸放置1.5ML灭菌的离心管中，即为模板，即用或
‑
20℃冻存备用；3)核酸扩增
①
配体系：严格按照宝生物一步法RT
‑
PCR检测试剂盒说明书进行，总体系25μL，其中2
×
1step Buffer 12.5μL，PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μL，10uM CSFV上游引物0.8μL，10uM CSFV下游引物0.8μL，待检RNA摸板3μL；
②
RT
‑
PCR程序：50℃逆转录30min；94℃预变性2min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存；4)核酸电泳检测：取5μL PCR产物，混合2μLloadingBuffer，1％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，以DNA分子量标准DL2...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁英旦，邹振强，全方贤，杜清林，阳林芳，宋德清，
申请(专利权)人：广东壹号地方猪研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：