一种多类型靶标联合检测的试剂盒及制备方法、使用方法技术

本发明专利技术涉及生物检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种多类型靶标联合检测的试剂盒及制备方法、使用方法。该试剂盒包括标记抗体悬液、质控抗体悬液、荧光分子信标悬液和试纸条；标记抗体悬液中包含荧光微球标记的抗EpCAM抗体，质控抗体悬液中包含荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体，荧光分子信标悬液中包含荧光miR

【技术实现步骤摘要】
一种多类型靶标联合检测的试剂盒及制备方法、使用方法


[0001]本专利技术涉及生物检测试剂盒
，尤其涉及一种多类型靶标联合检测的试剂盒及制备方法、使用方法。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡是由哺乳动物细胞主动向细胞外释放的纳米级双层囊泡小体，直径一般在30
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150nm之间。细胞外囊泡的内含物中包含核酸（DNA、mRNA、microRNA、IncRNA、circRNA等）、蛋白质和脂质等成分。由于磷脂双分子层的包裹，细胞外囊泡内含物可以较稳定地存在于机体的体液中，并跟随体液循环到达身体的不同部位，实现细胞间的远距离通讯。几乎所有动物体液中都有检测到细胞外囊泡的存在，主要包括血液、尿液、脑脊液、唾液、胸腔积液、腹水和羊水。现阶段，细胞外囊泡以其取样方式安全灵活、无创便捷、可以规律反复多次取样、依从性高等特点而在液体活检领域迅速发展。
[0003]近年来，研究者们针对细胞外囊泡检测开发了多种生物传感器。其中，侧向层析（Lateral flow assays，LFA）是目前体外诊断中应用最广泛的方法，其具有成本低、操作简便、无需配合大型仪器与专业人员，在基层或偏远地区的临床诊断中也可得到充分利用，非常适合用于对疾病的大规模筛查。现已有多个研究团队针对细胞外囊泡体外诊断开发了LFA方法。Myriam Oliveira
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guez等人在2016年首次通过以胶体金为信号物，CD9和CD63双抗体夹心检测原理构建了细胞外囊泡LFA试纸。经过对比优化，该试纸能够在15分钟内检测出细胞外囊泡的数量，LOD（最低检测限）为8.54
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105个细胞外囊泡/mL。Tingting Wu等人则通过让不同粒径的胶体金分子形成复合体，开发了细胞外囊泡胶体金信号增强试纸。上述基于胶体金信号与双抗体夹心原理的LFA试纸均为经典构建方法，但可视化信号读数的局限性在很大程度上限制了此类方法的最低检测限和有效线性检测范围。
[0004]虽然上述团队均利用双抗体夹心法实现了对细胞外囊泡的定量检测，但由于这些检测方法针对细胞外囊泡膜蛋白进行检测，仅能完成对细胞外囊泡总量测定，未充分利用细胞外囊泡所携带的多类型生物信息。Zhou等研究者于2020年首次报导了一种细胞外囊泡miRNA与膜蛋白检测的通用芯片，并通过将多路通道合并的方式进行多类型靶标联合分析。虽然这种多类型靶标联合分析方法有效将胰腺癌诊断的准确率从70%提高至100%，但其检测芯片仍然依赖于微流控系统，样品检测及信号读取步骤较为复杂，同时需要配合专业操作人员与大型设备。
[0005]可见，如何实现在LFA试纸上完成多类型靶标的联合检测，是目前制约该类产品发展的关键问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提出一种多类型靶标联合检测的试剂盒，该试剂盒能够实现细胞外囊泡膜蛋白和miRNA联合检测，检测速度快、准确率高。
[0007]本专利技术的目的在于提出一种多类型靶标联合检测的试剂盒的制备方法，该制备方
法步骤简单易操作；本专利技术的目的在于提出一种试剂盒使用方法，使细胞外囊泡与囊泡融合，对细胞外囊泡的尺寸进行扩大，提高检测稳定性。
[0008]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一种多类型靶标联合检测的试剂盒，包括标记抗体悬液、质控抗体悬液、荧光分子信标悬液和试纸条；所述标记抗体悬液中包含荧光微球标记的抗EpCAM抗体，所述质控抗体悬液中包含荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体，所述荧光分子信标悬液中包含荧光miR
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21分子信标；所述试纸条包括依次设置的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，且两两之间均具有重叠部分；所述结合垫设有miRNA检测区；沿由所述结合垫至所述吸水垫的方向，所述层析膜依次设有检测线和质控线；所述检测线由羊抗鼠IgG抗体形成，所述质控线由鸡IgY蛋白形成。
[0009]进一步的，所述标记抗体悬液中，所述抗EpCAM抗体的浓度为10
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50μg/ml。
[0010]进一步的，所述质控抗体悬液中，所述羊抗鸡IgY抗体的浓度为10
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50μg/ml。
[0011]进一步的，所述荧光分子信标悬液中还包含囊泡，所述囊泡内包裹有所述荧光miR
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21分子信标。
[0012]一种多类型靶标联合检测的试剂盒的制备方法，该方法用于制备上述的试剂盒，该方法包括以下步骤：（1）制备标记抗体悬液：将活化后的荧光微球与所述抗EpCAM抗体反应，加入标记抗体复溶液，制成标记抗体悬液并冷藏；（2）制备质控抗体悬液：将活化后的荧光微球与所述羊抗鸡IgY抗体反应，加入标记抗体复溶液，制成质控抗体悬液并冷藏；（3）制备荧光分子信标悬液：根据miR
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21序列合成miR
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21分子信标，并在miR
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21分子信标的5
’
端荧光基团和在3
’
端修饰淬灭基团得到荧光miR
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21分子信标，将溶于缓冲液，之后加入囊泡，充分反应，得到荧光分子信标悬液并冷藏；（4）制备试纸条：将羊抗鼠IgG抗体和鸡IgY蛋白分别以喷金划膜仪以0.5
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2μL/cm的量包被到层析膜上，分别作为检测线和质控线，组装样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，得到试纸条。
[0013]进一步的，所述步骤（1）和所述步骤（2）中，所述荧光微球为铕荧光乳胶微球，以碳二亚胺和N
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羟基琥珀酰亚胺对荧光微球进行表面活化；所述碳二亚胺和N
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羟基琥珀酰亚胺的总质量与所述铕荧光乳胶微球的质量之比为10:1~1:1。
[0014]进一步的，所述步骤（1）中，在1 mL铕荧光乳胶微球溶液中按比例分别加入碳二亚和N
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羟基琥珀酰亚胺对微球进行表面活化，充分反应后进行离心，弃上清，得到沉淀；之后，用0.5
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2 mL缓冲液重悬沉淀，并加入1
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100 μg抗EpCAM抗体，充分反应，随后加入1%
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50% BSA封闭剂进行封闭，得到封闭后的沉淀；用0.1
‑
2 mL标记抗体复溶液重悬封闭后的沉淀，得到标记抗体悬液，置于3
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5℃环境保存备用。
[0015]进一步的，所述步骤（2）中，在1 mL铕荧光乳胶微球溶液中按比例分别加入碳二亚胺和N
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羟基琥珀酰亚胺对微球进行表面活化，充分反应后进行离心，弃上清，得到沉淀；之后，用0.5
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2 mL缓冲液重悬沉淀，并加入1
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100μg 羊抗鸡IgY抗体，充分反应，随后加入1%
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20% BSA封闭剂进行封闭，得到封闭后的沉淀；用0.1
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2 mL标记抗体复溶液重悬封闭后的沉淀，得到标记抗体悬液，置于3
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5℃环境保存备用。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多类型靶标联合检测的试剂盒，其特征在于，包括标记抗体悬液、质控抗体悬液、荧光分子信标悬液和试纸条；所述标记抗体悬液中包含荧光微球标记的抗EpCAM抗体，所述质控抗体悬液中包含荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体，所述荧光分子信标悬液中包含荧光miR
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21分子信标；所述试纸条包括依次设置的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，且两两之间均具有重叠部分；所述结合垫设有miRNA检测区；沿由所述结合垫至所述吸水垫的方向，所述层析膜依次设有检测线和质控线；所述检测线由羊抗鼠IgG抗体形成，所述质控线由鸡IgY蛋白形成。2.根据权利要求1所述的多类型靶标联合检测的试剂盒，其特征在于，所述标记抗体悬液中，所述抗EpCAM抗体的浓度为10
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50μg/ml。3.根据权利要求1所述的多类型靶标联合检测的试剂盒，其特征在于，所述质控抗体悬液中，所述羊抗鸡IgY抗体的浓度为10
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50μg/ml。4.根据权利要求1所述的多类型靶标联合检测的试剂盒，其特征在于，所述荧光分子信标悬液中还包含囊泡，所述囊泡内包裹有所述荧光miR
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21分子信标。5.一种多类型靶标联合检测的试剂盒的制备方法，其特征在于，该方法用于制备权利要求1
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4任一项所述的试剂盒，该方法包括以下步骤：（1）制备标记抗体悬液：将活化后的荧光微球与所述抗EpCAM抗体反应，加入标记抗体复溶液，制成标记抗体悬液并冷藏；（2）制备质控抗体悬液：将活化后的荧光微球与所述羊抗鸡IgY抗体反应，加入标记抗体复溶液，制成质控抗体悬液并冷藏；（3）制备荧光分子信标悬液：根据miR
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21序列合成miR
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21分子信标，并在miR
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21分子信标的5
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端荧光基团和在3
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端修饰淬灭基团得到荧光miR
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21分子信标，将溶于缓冲液，之后加入囊泡，充分反应，得到荧光分子信标悬液并冷藏；（4）制备试纸条：将羊抗鼠IgG抗体和鸡IgY蛋白分别以喷金划膜仪以0.5
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2μL/cm的量包被到层析膜上，分别作为检测线和质控线，组装样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，得到试纸条。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）和所述步骤（2）中，所述荧光微球为铕荧光乳胶微球，以碳二亚胺和N
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羟基琥珀酰亚胺对荧光微球...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐勇，路程，肖威，
申请(专利权)人：广东忠信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：