一种含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法技术

本发明专利技术公开了含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法，将重组病毒接种5龄家蚕幼虫，桑叶添食后收集蚕丝，得到含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝；所述重组病毒含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的序列；重组病毒AcNPV

【技术实现步骤摘要】
一种含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种通过家蚕生产含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝。

技术介绍

[0002]近年来，人们已可以通过基因工程技术在细菌、酵母、哺乳类动物培养细胞、昆虫细胞甚至通过转基因动物和植物表达蛛丝蛋白，但这些表达的蛋白不能自主装配成丝纤维，须通过人工纺丝的技术进一步加工成丝纤维，但目前通过这种技术还难以大量获取机械性优异的蛛丝纤维。另外由于主壶腹腺丝蛋白的分子量巨大，且高度重复，当用异源系统表达时往往重组蛛丝蛋白分子量低于自然状态，且表达水平低下，而人工纺丝所获得的丝的机械性与丝蛋白的分子量有正相关性。几千年来，饲养家蚕是丝绸工业的基础，家蚕是唯一能室内规模饲养大量提供丝纤维的昆虫。蚕丝蛋白主要由丝胶蛋白和丝素蛋白组成，而丝纤维主要由不溶于水的丝素蛋白重链（350kDa）、丝素蛋白轻链（25.8kDa）以及P25蛋白(25.7kDa)按6:6:1的摩尔比装配而成，蚕丝蛋白的机械性能主要由丝素蛋白重链的高分子量和氨基酸序列的高度重复决定。很长时间以来，人们一直希望利用家蚕高效合成丝蛋白以及天然的纺丝能力生产蛛丝。目前，将合成的络新妇蛛（Nephila clavipes）、大腹园蛛(Araneus ventricosus)主壶腹腺丝蛋白基因的重复模序经过多次重复后，通过piggyBac介导的转基因已实现了非完整蛛丝蛋白基因在家蚕中的表达，并通过家蚕天然的纺丝能力获得含有蛛丝蛋白成份的嵌合蚕丝，在一定程度上改善了丝纤维的机械性能，但该丝纤维中蛛丝蛋白的含量非常有限；现有技术公开了一种蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法，蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因为黑寡妇蜘蛛葡萄状腺丝或者园蛛葡萄状腺丝1倍碱基重复单元以1
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8倍连续重复构成的基因序列，具有改良家蚕丝性能等应用；先构建家蚕合成分泌葡萄状腺丝蛋白的载体pBac
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ACSP质粒，将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，用转座子使荧光蛋白基因和葡萄状腺丝蛋白基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，育成分泌蜘蛛葡萄状腺丝蛋白的转基因家蚕，其发现了一种蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因的用途，并开发了一种新型家蚕蜘蛛仿生丝的改良家蚕丝性能的生产方法。现有技术采用将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内的方法耗时长，且不适用二化性实用品种的蚕卵，而饲养这些蚕卵孵化的蚕才可以得到高性能优质蚕丝。

技术实现思路

[0003]本专利技术的专利技术目的是提供一种通过家蚕生产含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的复合蚕丝的方法。
[0004]为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将重组病毒接种5龄家蚕幼虫，桑叶添食后收集蚕丝，得到含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝；所述重组病毒含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的序列，重组病毒接
种5龄家蚕幼虫的量为104～108拷贝/蚕。
[0005]本专利技术中，将重组DNA转染培养细胞，然后培养至细胞发病，取细胞培养上清再次接种培养细胞，然后培养至细胞发病，收集细胞培养上清，得到重组病毒；所述重组DNA含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的序列。进一步的，将重组质粒转化DH10Ac大肠杆菌，后涂布于LB琼脂培养基平板上，然后培养，再挑取白色菌落，提取重组DNA；所述DH10Ac大肠杆菌含有AcBacmid；所述重组质粒含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的序列，优选的，所述LB琼脂培养基含有四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG和X
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gal，四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG 和X
‑
gal的浓度分别为10
ꢀµ
g/ml、50
ꢀµ
g/ml、7
ꢀµ
g/ml、40
µ
g/ml和100
ꢀµ
g/ml。
[0006]本专利技术中，将含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白序列的DNA片段克隆入质粒，得到重组质粒；所述含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白序列的DNA片段的序列为SEQ ID NO: 1；所述质粒为pFAST
‑
Bac
‑
Dual。合成SEQ ID NO: 1所示FibH
‑
MaSp
‑
g
‑
polyA
Fib
表达盒的优选方案是采用全化学合成的方法；也可以家蚕基因组为模板通过PCR获得带有编码信号肽序列的启动子序列和加尾信号序列，以金丝织网蜘蛛大壶状腺的RNA为模板通过RT
‑
PCR的方法获得MaSp
‑
g序列，然后通过拼接获得FibH
‑
MaSp
‑
g
‑
polyA
Fib
表达盒；也可以通过PCR扩增与化学合成相结合的方法制备FibH
‑
MaSp
‑
g
‑
polyA
Fib
表达盒。克隆可以采用酶切连接的方法，也可以通过无缝克隆的方法。
[0007]本专利技术，桑叶添食时添加抗生素、蜕皮激素，具体的，将重组病毒接种5龄家蚕幼虫后，添食含有抗生素的桑叶一天，然后添食常规桑叶，至熟蚕，然后添食含有蜕皮激素的桑叶一次或者喷洒蜕皮激素一次，再进行收集蚕丝；其中收集蚕丝为常规技术，包括上蔟、营茧、采茧、缫丝。
[0008]本专利技术接种的家蚕品种优选丝茧育实用家蚕品种，如菁松
×
皓月、中2016
×
日2016，也可以选用家蚕原种，如J14
‑
花，本专利技术方法具有普适性，成功解决了现有方法不适用二化性蚕种的技术缺陷。优选的接种的5龄家蚕幼虫的发育时期为5龄蜕皮后1
‑
3天。接种病毒时可以用4号昆虫针醮取收集的细胞培养上清或离心纯化的病毒穿刺接种家蚕幼虫，优选的，重组病毒接种5龄家蚕幼虫的量为105～107拷贝/蚕。本专利技术首先合成家蚕丝素蛋白重链基因启动子控制的5
’
端带有编码信号肽序列、3
’
端带有加尾信号的金丝织网蜘蛛的大壶状腺丝蛋白基因表达盒FibH
‑
MaSp
‑
g
‑
polyA
FibH
，其序列如SEQ ID NO: 1；再将其克隆进pFAST
‑
Bac
Tm
‑
Dual的多克隆位点构建质粒pFAST
‑
FibH
‑
MaSp
‑
g；然后将质粒转化含有AcBacmid DH10Ac大肠杆菌，后涂布于含有四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG 和X
‑
gal的LB 琼脂培养基平板上，常规培养，再挑取白色菌落，提取重组AcBacmid
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FibH
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将重组病毒接种5龄家蚕幼虫，添食桑叶后收集蚕丝，得到含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝；所述重组病毒含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的序列。2.根据权利要求1所述含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法，其特征在于，添食桑叶时添加抗生素、蜕皮激素。3.根据权利要求1所述含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法，其特征在于，将重组DNA转染培养细胞，然后培养至细胞发病，取细胞培养上清再次接种培养细胞，然后培养至细胞发病，收集细胞培养上清，得到重组病毒；所述重组DNA含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的序列。4.根据权利要求3所述含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法，其特征在于，将重组质粒转化DH10Ac大肠杆菌，后涂布于LB琼脂培养基平板上，然后培养，再挑取白色菌落，提取重组DNA；所述DH10Ac大肠杆菌含有AcBacmid；所述重组质粒含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的序列。5.根据权利要求4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：贡成良，王崇龙，胡小龙，李继杰，朱敏，张星，童新宇，邱群婻，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：