羟甲基香豆素在制备抗沙门氏菌毒力抑制剂中的应用制造技术

本发明专利技术涉及羟甲基香豆素在制备沙门氏菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)抑制剂及抗沙门氏菌感染药物中的应用。通过体外细胞(人宫颈癌细胞系，HeLa)感染保护实验及鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的治疗试验证实羟甲基香豆素通过抑制T3SS的功能来发挥沙门氏菌感染。与传统抗生素相比，羟甲基香豆素可通过抑制T3SS的功能来发挥抗感染的作用，故不易诱导细菌耐药性的产生。故不易诱导细菌耐药性的产生。故不易诱导细菌耐药性的产生。

【技术实现步骤摘要】
羟甲基香豆素在制备抗沙门氏菌毒力抑制剂中的应用


[0001]本专利技术涉及羟甲基香豆素抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)及在制备治疗沙门氏菌感染药物中的应用，属于医学制药


技术介绍

[0002]7‑
羟基
‑4‑
甲基香豆素，又称羟甲基香豆素，英文名称4
‑
Methylumbelliferone，属香豆素衍生物。常温下为白色或类白色结晶性粉末，无臭，无味。不溶于水，略溶于甲醇、乙醇，易溶于氢氧化钠溶液。羟甲基香豆素是一种利胆药，也是抗过敏药色甘酸钠的中间体。对胆道口括约肌有舒张作用，具有较强的解痉、镇痛作用，同时也能温和、持续地促进胆汁分泌，加强胆囊收缩和抑菌作用，具有明显的利胆作用，有利于结石排出，对胆总管结石有一定排石效果。
[0003]鼠伤寒沙门氏菌是一种人畜共患食源性细菌病原体，可导致全球人类和动物食物中毒，并对公众健康和食品安全构成严重威胁。目前，抗生素被广泛用于治疗鼠伤寒沙门氏菌感染，但长期使用抗生素不可避免地导致细菌耐药性的产生。随着抗生素耐药性的增加，细菌感染的治疗几乎变得无效，迫切需要一种新的治疗策略来对抗感染。
[0004]抗毒力策略是非常有前景的解决抗生素耐药问题的手段之一。沙门氏菌T3SS是一种类似注射器的精密分子机器，可促使细菌在宿主细胞中入侵和复制，也是筛选抗毒力抑制剂的重要靶标。沙门氏菌入侵宿主细胞需要SipA、SipB、SipC等T3SS效应蛋白进入宿主细胞，通过诱导宿主细胞骨架重构促进沙门氏菌入侵细胞。其中SipA是细菌入侵宿主细胞的关键蛋白，SipB则与SipC形成蛋白质复合物来促进鼠伤寒沙门氏菌宿主细胞的侵袭。因此，沙门氏菌T3SS毒力系统是抗毒力抑制剂研发的理想靶标。

技术实现思路

[0005]本专利技术所述羟甲基香豆素CAS登录号为90
‑
33
‑
5，分子式为C
10
H8O3，分子量为176.17。
[0006]羟甲基香豆素的化学结构式如下：
[0007][0008]本研究以沙门氏菌T3SS效应蛋白为药物靶标筛选得到的天然化合物羟甲基香豆素在较低浓度下通过阻断T3SS关键效应蛋白SipA的转运而抑制沙门氏菌T3SS的功能，显著降低效应蛋白SipB的表达水平且不影响细菌生长。体外试验表明，经羟甲基香豆素预处理沙门氏菌后，沙门氏菌侵入HeLa细胞的能力显著降低。体内试验中，经羟甲基香豆素治疗后沙门氏菌感染小鼠存活率达30％，靶器官(肝脏、脾脏)菌落定殖数显著降低。
附图说明
[0009]图1：流式细胞术检测羟甲基香豆素抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的能力(横坐标代表蓝色荧光强度，蓝色荧光表明T3SS分泌功能正常，即表示效应蛋白SipA能够正常转运；纵坐标表示细胞数量)
[0010]图2：羟甲基香豆素治疗显著提高沙门氏菌感染小鼠保护率(横轴表示时间，纵轴表示存活率)
[0011]图3：羟甲基香豆素降低感染小鼠靶器官菌落定殖数(横轴表示不同处理组肝脏、脾脏，纵轴为菌落定殖数)
具体实施方式
[0012]通过以下实施进一步举例描述本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术，在不背离本专利技术的技术解决方案的前提下，对本专利技术所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本专利技术的权利要求范围之内。
[0013]实施例1
[0014]羟甲基香豆素作为沙门氏菌T3SS抑制剂及在制备治疗沙门氏菌感染药物中的作用，用于药学上可接受的任何载体。
[0015]实施例2
[0016]羟甲基香豆素作为沙门氏菌T3SS抑制剂用于制备治疗感染性疾病的药物。
[0017]实施例3
[0018]羟甲基香豆素作为沙门氏菌T3SS抑制剂用于治疗细菌引起的感染性疾病，特别是由沙门氏菌引起的人畜感染，包括伤寒、副伤寒、胃肠炎和鸡白痢等疾病。
[0019]1.沙门氏菌III型分泌系统抑制剂的筛选
[0020]以SipA
‑
β内酰胺酶融合报告质粒(SipA
‑
TEM)系统及其荧光底物CCF4检测受试化合物对沙门氏菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)功能的影响，TEM可以水解CCF4，水解前的CCF4呈现蓝色荧光，水解后则呈现绿色荧光。通过天然化合物与沙门氏菌提前共孵育后感染细胞，以感染细胞后呈现不同颜色荧光信号进行抑制剂的筛选，并通过流式细胞术分析荧光信号强度。
[0021]结果表明：SipA
‑
TEM报告质粒系统的流式分析结果显示，与阳性对照组相比(T3SS效应蛋白SipA能够正常转运至细胞内，呈现蓝色荧光的细胞比例为91.3％)，羟甲基香豆素在浓度为64μg/ml时可以显著抑制沙门氏菌T3SS效应蛋白SipA的转运，失去正常功能(被检细胞群体种，蓝色细胞比例仅为7.74％)，沙门氏菌invA基因敲除株感染组蓝色细胞比例为4.50％，结论：羟甲基香豆素通过抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统效应蛋白SipA的转运和入侵相关效应蛋白SipB的表达而影响沙门氏菌T3SS的功能(见附图1)。
[0022]2.羟甲基香豆素对沙门氏菌生长的影响
[0023]沙门氏菌接种至LB液体培养基(0.3M NaCl)中过夜培养(37℃，200rpm)，次日1:100扩培至OD
600nm
为0.3左右，分装至锥形瓶(20ml/瓶)，分别设定不加药物组和不同浓度羟甲基香豆素处理组。37℃，200rpm继续培养，每隔30min测定并记录每组样品的OD
600nm
，直至细菌生长至平台期。
[0024]结果表明：在7h的培养时间内，羟甲基香豆素处理组(0～64μg/ml)与未加药物处
理组相比，细菌生长至平台期OD
600nm
值无显著差异，表明羟甲基香豆素在有效浓度范围内不影响细菌正常生长(见附表1)。
[0025]附表1羟甲基香豆素对沙门氏菌(SL1344)生长的影响测定
[0026][0027]3.羟甲基香豆素对沙门氏菌入侵宿主细胞的影响
[0028]1:20将SL1344扩培至0.3M氯化钠的链霉素LB培养基中，加入不同浓度羟甲基香豆素，设置等体积DMSO对照，在37℃，180rpm条件下培养4h。移去24孔板中细胞培养液，加入准备好的菌悬液，感染1h。将培养基替换成含有100μg/ml的庆大霉素继续孵育1h，HBSS轻柔洗涤细胞3次，加入500μl 0.2％的皂苷，裂解HeLa细胞，100倍稀释细胞裂解液，涂于链霉素抗性LB固体培养基，37℃过夜培养，次日计数。(见附表2)
[0029]附表2羟甲基香豆素对HeLa细胞入侵测定
[0030][0031]4.羟甲基香豆素对小鼠沙门氏菌感染的保护作用
[0032]4.1沙门氏菌感染小鼠模型的建立
[0033]6‑
8周龄雌性Balb/c小鼠(体重18～22g)，适应性饲养2～3天，5g/L链霉素饮水本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.羟甲基香豆素在制备沙门氏菌Ⅲ型分泌系统抑制剂中的应用。2.如权利要求1所述羟甲基香豆素在制备沙门氏菌Ⅲ型分泌系统抑制剂中的应用，其特征在于所述的药物羟甲基香...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱家章，刘洪涛，舒婧妍，邓旭明，王建锋，冯海华，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：