一种罗非鱼链球菌病双重荧光PCR检测引物探针组及冻干型试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，公开了一种罗非鱼链球菌病双重荧光PCR检测引物探针组及冻干型试剂盒，具体公开了一种试剂，包括引物组和/或探针组。本发明专利技术提供的试剂可用于同时检测无乳链球菌和海豚链球菌，实现在一管反应中只进行1次PCR扩增即可对罗非鱼链球菌病的两种病原进行检测。两种病原进行检测。

【技术实现步骤摘要】
一种罗非鱼链球菌病双重荧光PCR检测引物探针组及冻干型试剂盒


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种罗非鱼链球菌病双重荧光PCR检测引物探针组及冻干型试剂盒。

技术介绍

[0002]罗非鱼是我国主要的水产养殖品种之一，养殖量和养殖规模都在逐年增加，但随着养殖密度的提高，罗非鱼的各种疫病的发病率也出现了升高的趋势，养殖疫病成了限制养殖产量的重要因素之一。罗非鱼链球菌病是罗非鱼养殖中的常见疫病之一，具有发病率和死亡率高的特征，给罗非鱼养殖业造成了严重的经济损失。研究表明，罗非鱼链球菌病的主要致病菌是无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚链球菌(Streptococcus iniae)，这两种病原通常会交替出现，导致养殖罗非鱼感染链球菌病。此外，除罗非鱼外，这两种链球菌还能感染超过20种海洋和淡水鱼类，且在一定条件下可以通过病鱼感染人、畜，属于人、畜、鱼共患致病菌，因此不论从养殖安全角度还是食品安全角度，这两种罗非鱼链球菌的检测都具有重要意义。
[0003]在罗非鱼链球菌病的诊断上，仅从外部症状和菌落形态上，很难和其他病害区分开，而常规诊断方法如细菌培养、生化实验、药敏实验和分子检测等，目前最常用的罗非鱼链球菌病的检测方法还是平板培养，但是细菌培养周期通常需要2～3天，不仅周期长，容易延误最佳用药时机，而且通过菌落形态无法区分两种链球菌，也容易和其他相似菌落混淆。目前常用的分子检测方法有普通PCR法、荧光PCR法、数字PCR法、恒温法LAMP法，恒温RAA法等。在2020年的水产行业标准中开始使用普通PCR来进行检测，证明了分子检测的可行性，但是普通PCR检测不仅需要电泳跑胶，片段还需要回收测序才能最终判定，周期仍然较久，而且普通PCR在检测灵敏度和特异性上也较荧光PCR方法低，同时普通PCR检测操作步骤较多，且需要固定的检测环境，基本只能在专业的检测实验室，由专业检测人员操作，且该方法只能实现定性不能实现定量，不便于进行临床快速检测和使用推广。目前能做到定量和定性检测的目前只有荧光PCR方法和以荧光PCR法为基础的数字PCR法，而数字PCR因设备昂贵，且通量较小，不适合普通检测实验室大量检测需求。在过去荧光PCR受限与设备问题，推广较少，但近年来随着荧光PCR技术在非洲猪瘟和新冠检测上的应用，荧光PCR检测设备也逐步做到了国产化、小型化，出现了一大批具备性价比优势或便携性优势的荧光PCR仪，具备了将荧光PCR技术推广到兽医检测上的基础条件。目前水产疫病检测技术还处于发展阶段，一方面很多水产疫病缺乏精准检测方法，另一方面，水产疫病精准诊疗的另一个限制因素就是常规实验室检测方法耗时太久，而水产疫病爆发较快，等实验室结果出来可能已经错过最佳治疗时机。

技术实现思路

[0004]本专利技术第一方面的目的，在于提供一种试剂。
[0005]本专利技术第二方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的试剂的制备方法。
[0006]本专利技术第三方面的目的，在于提供一种试剂盒。
[0007]本专利技术第四方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的试剂或本专利技术第三方面的试剂盒的应用。
[0008]本专利技术第五方面的目的，在于提供一种同时检测无乳链球菌和/或海豚链球菌的双重荧光PCR检测方法。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
[0010]本专利技术的第一个方面，提供一种试剂，所述试剂包括引物组和/或探针组，所述引物组包括引物1和引物2，所述探针组包括探针1和探针2；
[0011]其中，所述引物1的序列为：
[0012]Saga
‑
rtF：5
’‑
AACGGTTAATGAGGCTATTACTAG
‑3’
(SEQ ID NO.1)，或为该序列的互补序列；
[0013]Saga
‑
rtR：5
’‑
AGGCTTCTACACGACTACC
‑3’
(SEQ ID NO.2)，或为该序列的互补序列；
[0014]所述引物2的序列为：
[0015]Sini
‑
rtF：5
’‑
GGAAGTACGTTTGGAAGTCTTA
‑3’
(SEQ ID NO.7)，或为该序列的互补序列；
[0016]Sini
‑
rtR：5
’‑
CGAACTAAAATCTTAGTGAAAATGA
‑3’
(SEQ ID NO.8)，或为该序列的互补序列；
[0017]所述探针1的序列为：
[0018]Saga
‑
rtProbe：5
’‑
AGACTTCATTGCGTGCCAACCCTGAGA
‑3’
(SEQ ID NO.3)，或为该序列的互补序列；
[0019]所述探针2的序列为：
[0020]Sini
‑
rtProbe：5
’‑
TAGGAAAGAGACGCAGTGTCAAAAGAC
‑3’
(SEQ ID NO.9)，或为该序列的互补序列。
[0021]优选地，所述探针序列两端均分别标记有荧光基团和淬灭基团，各探针序列之间标记的荧光基团不同。
[0022]优选地，所述荧光基团为FAM、HEX、HTX、VIC、TAMRA、ROX和CY5中的至少一种。
[0023]优选地，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2和BHQ3中的至少一种。
[0024]进一步优选地，所述荧光基团连接在引物的5
’
端。
[0025]进一步优选地，所述淬灭基团连接在引物的3
’
端。
[0026]进一步优选地，所述探针1的5
’
端连接荧光基团FAM，3
’
端连接淬灭基团BHQ1。
[0027]进一步优选地，所述探针2的5
’
端连接荧光基团HEX，3
’
端连接淬灭基团BHQ1。
[0028]优选地，所述试剂还包括冻干保护剂。
[0029]优选地，所述冻干保护剂为海藻糖、蜜三糖、甘露醇、甘氨酸、PEG中的一种或多种。
[0030]优选地，所述冻干保护剂为海藻糖、蜜三糖、甘露醇、甘氨酸、PEG的水溶液。
[0031]进一步优选地，所述冻干保护剂为10％～15％(m/v)海藻糖、1％～5％(m/v)蜜三糖、10％～15％(m/v)甘露醇、1％～4％(m/v)甘氨酸、5％～7％(m/v)PEG的水溶液。
[0032]优选地，所述试剂还包括PCR反应液。
[0033]优选地，所述PCR反应液包括UNG酶。
[0034]进一步优选地，所述UNG酶的终浓度为0.2～0.5U/μL。
[0035]优选地，所述PCR反应液还包括钙离子、buffer、dNT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种试剂，其特征在于，所述试剂包括引物组和/或探针组，所述引物组包括引物1和引物2，所述探针组包括探针1和探针2；其中，所述引物1的序列为：Saga
‑
rtF：5
’‑
AACGGTTAATGAGGCTATTACTAG
‑3’
，或为该序列的互补序列；Saga
‑
rtR：5
’‑
AGGCTTCTACACGACTACC
‑3’
，或为该序列的互补序列；所述引物2的序列为：Sini
‑
rtF：5
’‑
GGAAGTACGTTTGGAAGTCTTA
‑3’
，或为该序列的互补序列；Sini
‑
rtR：5
’‑
CGAACTAAAATCTTAGTGAAAATGA
‑3’
，或为该序列的互补序列；所述探针1的序列为：Saga
‑
rtProbe：5
’‑
AGACTTCATTGCGTGCCAACCCTGAGA
‑3’
，或为该序列的互补序列；所述探针2的序列为：Sini
‑
rtProbe：5
’‑
TAGGAAAGAGACGCAGTGTCAAAAGAC
‑3’
，或为该序列的互补序列。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括冻干保护剂；优选地，所述试剂还包括PCR反应液。3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述冻干保护剂为海藻糖、蜜三糖、甘露醇、甘氨酸、PEG中的一种或多...

【专利技术属性】
技术研发人员：伍建敏，罗梦萍，李中圣，罗律，
申请(专利权)人：广东海大畜牧兽医研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：