一种特异识别AAV9衣壳蛋白的多克隆抗体及制备方法技术

本发明专利技术提供一种特异识别AAV9衣壳蛋白的多克隆抗体及制备方法，将8处AAV9衣壳可变区氨基酸序列依次连接即为本发明专利技术所指AAV9可变区VR的氨基酸序列SEQ ID NO.1，由氨基酸序列得到编码AAV9衣壳可变区的DNA序列如SEQ ID NO.2，将DNA序列插入到原核表达载体pET30a获得质粒pET30a

【技术实现步骤摘要】
一种特异识别AAV9衣壳蛋白的多克隆抗体及制备方法


[0001]本专利技术涉及一种医药生物化工
，具体地说，是关于一种特异性识别AAV9衣壳蛋白的多克隆抗体制备方法。

技术介绍

[0002]腺相关病毒（Adeno
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associated Virus ，AAV）属于细小病毒科依赖病毒属，该病毒在人类及灵长类等脊椎动物体内广泛存在，目前科学界普遍认为AAV不会引起人类疾病的产生。近年来国内外科研平台将AAV载体用于体内基因治疗的临床试验数量逐步增加，其优异的安全性，以及针对靶向器官组织的高效转导性，使其成为针对体内基因治疗的首选载体系统。AAV病毒粒子直径约25 nm，其中包裹着4.7 kb的单链DNA基因组，基因组由Rep基因和Cap基因组成，两侧是反向末端重复序列（inverted terminal repeats，ITR)，左侧的ORF编码四种复制蛋白，根据它们的分子量命名为：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，右侧的ORF通过不同起始密码子编码三个衣壳蛋白VP1、VP2和VP3，这三种结构蛋白共用一个共同的羧基末端，但具有不同的氨基末端，AAV组装过程中，VP1、VP2和VP3以1：1：10的比例形成二十面体病毒衣壳。
[0003]由于AAV不同血清型之间具有较高的保守性，大多AAV衣壳蛋白抗体缺乏特异性，往往一种抗体识别多种血清型AAV，目前市面上还没有特异性针对AAV9衣壳蛋白的商业化抗体。基于此，本专利技术根据AAV1
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AAV10衣壳蛋白一级结构序列分析，共发现8处AAV9衣壳可变区（Aa262
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269，Aa448
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483，Aa488
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510，Aa527
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540，Aa545
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557，Aa576
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601，Aa661
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668，Aa706
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718），将AAV9衣壳独有的可变区DNA序列进行人工拼接后合成，经过原核蛋白表达纯化，以纯化的蛋白为抗原免疫日本大耳朵白兔，制备兔多克隆抗体，采用多种方式验证人工制备的抗原任然保留了抗原性，并且理论上制备的抗体具有较好的特异性，仅能识别AAV9病毒衣壳蛋白，为后续研究AAV9的生物学功能以及AAV9载体的改造及优化奠定了基础。

技术实现思路

[0004]针对上述技术问题，本专利技术提供一种抗AAV9衣壳可变区的多克隆抗体，其特征在于，用于制备AAV9衣壳可变区多克隆抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其DNA编码序列为SEQ ID NO:2。
[0005]一种抗AAV9衣壳可变区的多克隆抗体的制备方法包括如下步骤：（1）获得AAV9衣壳蛋白可变区氨基酸序列；（2）编码步骤（1）中氨基酸序列为可变区的DNA序列并构建到pET
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30a原核表达载体，5
′
末端酶切位点为XhoⅠ，3
′
末端酶切位点为NdeⅠ，得到重组pET
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30a
‑
AAV9
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VR可变区蛋白质粒；（3）将重组pET
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30a
‑
AAV9
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VR可变区蛋白质粒导入大肠杆菌菌株 BL21（DE3）进行扩增，接种于含有卡拉霉素的琼脂平板培养基上进行阳性克隆的筛选，纯化得到AAV9可变区蛋白；
（4）AAV9可变区蛋白免疫日本大耳朵白兔，得到抗AAV9衣壳可变区的多克隆抗体。
[0006]所述的AAV9衣壳蛋白可变区氨基酸序列为AAV9可变区中的Aa262
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269，Aa448
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483，Aa488
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510，Aa527
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540，Aa545
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557，Aa576
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601，Aa661
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668，Aa706
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718可变区序列拼接所得。
[0007]本专利技术将所述的抗AAV9衣壳可变区的多克隆抗体或所述的AAV9病毒载体在选择性识别AAV9病毒衣壳蛋白上的应用。
[0008]AAV载体具有免疫原性低、很少或几乎不整合宿主基因组、可实现组织异性等特点，目前AAV载体已逐渐成为体内基因治疗的主要载体。已有三种基于AAV载体的基因治疗药物上市，分别是Glybera、Luxturna和Zolgensma。Glybera采用AAV1携带脂蛋白脂酶基因，用于治疗遗传性脂蛋白酯酶缺乏的患者，于2012年10月获得欧洲药品管理局批准上市；Luxturna采用AAV2将正常的RPE65基因导入患者体内，用于治疗由RPE65基因突变导致的遗传性视网膜疾病，于2017年12月获得美国食品药品监督管理局批准；Zolgensma采用AAV9携带治疗基因SMN1，用于治疗2岁以下的脊髓性肌肉萎缩症患者，于2019年5月经美国食品药品监督管理局批准上市。AAV载体的开发以及优化离不开AAV抗体的使用，本研究旨在建立一种原核表达AAV9衣壳蛋白可变区抗原肽的方法以及制备一种特异性识别AAV9的多克隆抗体。
[0009]为获得大量可用作抗原免疫日本大耳朵白兔的AAV9可变区蛋白，我们将构建的pET
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30a
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AAV9
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VR原核表达质粒转化入大肠杆菌菌BL21（DE3）中。分析发现，细菌内AAV9可变区蛋白能被IPTG诱导性表达，且主要以包涵体的形式存在，这可能与AAV9可变区蛋白诱导性表达的速度过快和细菌内浓度过高有关。
[0010]由于重组AAV9可变区蛋白带有His标签，本专利技术在尿素变性的条件下利用Ni
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NTA树脂亲和层析法成功获得高纯度的AAV9可变区蛋白。为制备抗AAV9可变区蛋白多克隆抗体，我们将纯化后的AAV9可变区蛋白用做抗原免疫日本大耳朵白兔，经过1次启动免疫和2次加强免疫后，获得高效价的抗AAV9衣壳可变区多克隆抗体。该抗体能特异性识别和结合AAV9衣壳蛋白，而不能识别其他血清型AAV，如AAV2、AAV6等，可有效用于AAV9衣壳蛋白的免疫印迹、ELISA等生物化学分析实验。
[0011]综上所述，本实验成功建立了AAV9衣壳可变区的原核表达纯化技术，成功制备了抗AAV9衣壳可变区的多克隆抗体，制备的抗体理论上仅识别AAV9衣壳蛋白，上述研究有助于后续AAV载体的改造、新型AAV载体的筛选、AAV检测以及AAV生物学功能等研究。
附图说明
[0012]图1为pET30a
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AAV9
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VR可变区质粒的酶切鉴定，其中，M：DNAmaker1：AAV9可变区质粒2：XhoI+NdeI酶切后。
[0013]图2SDS
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PAGE分析AAV9可变区蛋白的诱导表达，其中，M：Proteinmarker；1：IPTG诱导0h；2：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗AAV9衣壳可变区的多克隆抗体，其特征在于，制备该抗体的衣壳蛋白可变区VR的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，编码可变区VR的DNA序列为SEQ ID NO:2。2.一种抗AAV9衣壳可变区的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）获得AAV9衣壳蛋白可变区氨基酸序列；（2）编码步骤（1）中氨基酸序列为可变区的DNA序列并构建到pET
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30a原核表达载体，5
′
末端酶切位点为XhoⅠ，3
′
末端酶切位点为NdeⅠ，得到重组pET
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30a
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AAV9
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VR可变区蛋白质粒；（3）将重组pET
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30a
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AAV9
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VR可变区蛋白质粒导入大肠杆菌菌株 BL21（DE3）进行扩增，接种于含有卡...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕亚丰，曹春雨，李舒月，张浩，秦宇，杨建林，王静，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：