一种番茄青枯病菌鉴定的特异性引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种番茄青枯病菌鉴定的特异性引物及其应用。本发明专利技术提供了一种用于鉴定或辅助鉴定青枯菌的引物对，由引物epsD

【技术实现步骤摘要】
一种番茄青枯病菌鉴定的特异性引物及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种番茄青枯病菌鉴定的特异性引物及其应用。

技术介绍

[0002]茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)又称青枯菌，由它所引起的植物细菌性青枯病是一种典型的土传性病害，在不同地区、不同温湿度条件、不同种植模式下，都可发病。发病条件不同，危害程度不同。田块间连作地、地势低洼、排水不良、土质偏酸的田块发病较重，在中国南方各地都有发生。青枯病菌一般从番茄根部或茎基部的伤口侵入，在植株体内的维管束组织中扩散，然后增殖至地上部，产生大量的胞外多糖堵塞维管束系统，使维管束功能被破坏，水分运输被阻断，植物出现萎蔫症状，直至死亡。番茄青枯病株的外部特征表现为阶段性萎蔫，叶片由绿转黄脱落，植株坏死腐烂，且茎部生出不定根。剖开病株地下组织，可观察到根部软化变褐，并发散臭味；轻压病株茎部切口可观察到乳白色菌脓溢出。青枯病发病急，蔓延快，发生严重时会引起植株成片死亡，造成严重减产，甚至绝收，给农户造成了严重的经济损失。番茄青枯病一旦爆发，防治非常困难。宜在早期检测出病害的发生，通过药剂防治，微生物防治等方法有效预防青枯病的大面积爆发。
[0003]细菌病原菌的检测方法主要分为：指示植物检测方法，平板划线分离方法，平板涂布分离方法，血清学方法，分子检测方法。传统的病原菌检测方法单一，耗时耗力，实时荧光定量PCR技术弥补这一不足。传统的细菌病原分离鉴定方法难以对土壤青枯病菌进行快速有效的检测，实时荧光定量PCR技术的出现解决了这个难题。通过设计特异性引物，利用实时荧光定量PCR技术对青枯菌进行菌量的检测。
[0004]青枯菌在营养丰富的环境，能合成胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)分泌到细胞壁外，有的胞外多糖分泌到胞外后依附于微生物细胞壁形成荚膜，称为荚膜多糖；有的胞外多糖分泌到胞外后进入培养基形成粘液，称为粘液多糖。胞外多糖，被广泛认为是青枯菌重要的致病因子。常见的产胞外多糖的细菌有乳酸菌、芽孢杆菌、假单胞菌、根瘤菌、醋酸杆菌、动胶菌、乳球菌、乳杆菌、链球菌、鞘氨醇杆菌等。胞外多糖(EPS)是青枯菌通过释放多种毒性因子侵害植株的复杂调控机制的其中之一。根据目前的研究，EPS的功能主要表现在以下4个方面：(1)胞外多糖以粘液状存在于菌体周围，能够帮助青枯菌扩散繁殖，协助其在寄主植物根部定殖，促进萎蔫症状的产生；(2)青枯菌在导管中生长时产生的大量胞外多糖会阻塞维管束系统，特别是叶柄结和小叶处孔径较小的导管穿孔板，导致植株运输系统的功能障碍，水分和养料无法流到枝叶上，从而引起植株萎蔫；(3)青枯菌产生的胞外多糖可以避免或降低植物对细菌的识别，可能在植物的自我防御系统中具有重要作用；(4)EPS可促进细菌对周围环境水分与养分的吸收。
[0005]青枯菌胞外多糖合成途径的许多蛋白质是由eps操纵子编码的，由调控基因和合成基因组成，它们在基因组上位点互不相邻，调控基因为合成基因的反式调控因子。目前，在青枯雷尔氏菌中成簇存在7个与胞外多糖合成相关的结构基因，分别是：epsA、epsP、
epsB、epsC、epsD、epsE和epsF。目前尚未有以epsD编码基因为靶标特异性鉴定青枯菌的相关报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是通过以epsD编码基因为靶标，设计并验证特异性引物，从而提供一种青枯菌检测的方法，对于青枯病的预防具有一定的应用价值。
[0007]第一方面，本专利技术要求保护一种用于鉴定或辅助鉴定青枯菌的引物对。
[0008]本专利技术要求保护的用于鉴定或辅助鉴定青枯菌的引物对，由引物epsD
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F和引物epsD
‑
R组成；所述引物epsD
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F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物epsD
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0009]第二方面，本专利技术要求保护用于鉴定或辅助鉴定青枯菌的试剂或试剂盒。
[0010]本专利技术要求保护的用于鉴定或辅助鉴定青枯菌的试剂或试剂盒，包括前文第一方面中所述引物对。
[0011]所述试剂或试剂盒中还可含有除所述引物对外的其他试剂，如PCR反应缓冲液、DNA聚合酶等。
[0012]第三方面，本专利技术要求保护如下任一方法：
[0013]方法I：前文第一方面中所述引物对的制备方法，可包括将所述引物epsD
‑
F和所述引物epsD
‑
R分别单独包装的步骤；
[0014]方法II：前文第二方面中所述试剂或试剂盒的制备方法，可包括将所述引物epsD
‑
F和所述引物epsD
‑
R分别单独包装的步骤。
[0015]第四方面，本专利技术要求保护如下任一应用：
[0016]P1、前文第一方面中所述引物对或前文第二方面中所述试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定青枯菌中的应用；
[0017]P2、前文第一方面中所述引物对在制备用于鉴定或辅助鉴定青枯菌的产品中的应用；
[0018]P3、前文第一方面中所述引物对或前文第二方面中所述试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测菌是否为青枯菌中的应用；
[0019]P4、前文第一方面中所述引物对在制备用于鉴定或辅助鉴定待测菌是否为青枯菌的产品中的应用；
[0020]P5、前文第一方面中所述引物对或前文第二方面中所述试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测生物样品中是否含有青枯菌中的应用；
[0021]P6、前文第一方面中所述引物对在制备用于鉴定或辅助鉴定待测生物样品中是否含有青枯菌的产品中的应用；
[0022]P7、前文第一方面中所述引物对或前文第二方面中所述试剂或试剂盒在检测待测生物样品中青枯菌含量中的应用；
[0023]P8、前文第一方面中所述引物对在制备用于检测待测生物样品中青枯菌含量的产品中的应用。
[0024]第五方面，本专利技术要求保护一种鉴定或辅助鉴定青枯菌的方法。
[0025]本专利技术要求保护的鉴定或辅助鉴定青枯菌的方法，可包括如下步骤：以待测生物
样品的基因组DNA为模板，用前文第一方面中所述引物对进行PCR扩增得到扩增产物，检测所述扩增产物的大小，如果所述扩增产物含有(或为)100
‑
250bp的DNA片段，则所述待测生物样品为或候选为青枯菌或者含有或候选含有青枯菌；如果所述扩增产物不含有(或不为)100
‑
250bp的DNA片段，则所述待测生物样品不为或候选不为青枯菌或者不含有或候选不含有青枯菌。
[0026]其中，所述100
‑
250bp的DNA片段具体为192bp的DNA片段。
[0027]进一步地，所述192bp的DNA片段的核苷酸序列具体如SEQ ID No.3所示。
[0028]第六方面，本专利技术要求保护一种鉴定或辅助鉴定青枯菌的方法。
[0029本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定或辅助鉴定青枯菌的引物对，由引物epsD
‑
F和引物epsD
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R组成；所述引物epsD
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F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物epsD
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R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。2.用于鉴定或辅助鉴定青枯菌的试剂或试剂盒，包括权利要求1所述引物对。3.如下任一方法：方法I：权利要求1所述引物对的制备方法，包括将所述引物epsD
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F和所述引物epsD
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R分别单独包装的步骤；方法II：权利要求2所述试剂或试剂盒的制备方法，包括将所述引物epsD
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F和所述引物epsD
‑
R分别单独包装的步骤。4.如下任一应用：P1、权利要求1所述引物对或权利要求2所述试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定青枯菌中的应用；P2、权利要求1所述引物对在制备用于鉴定或辅助鉴定青枯菌的产品中的应用；P3、权利要求1所述引物对或权利要求2所述试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测菌是否为青枯菌中的应用；P4、权利要求1所述引物对在制备用于鉴定或辅助鉴定待测菌是否为青枯菌的产品中的应用；P5、权利要求1所述引物对或权利要求2所述试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测生物样品中是否含有青枯菌中的应用；P6、权利要求1所述引物对在制备用于鉴定或辅助鉴定待测生物样品中是否含有青枯菌的产品中的应用；P7、权利要求1所述引物对或权利要求2所述试剂或试剂盒在检测待测生物样品中青枯菌含量中的应用；P8、权利要求1所述引物对在制备用于检测待测生物样品中青枯菌含量的产品中的应用。5.一种鉴定或辅助鉴定青枯菌的方法，包括如下步骤：以待测生物样品的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增得...

【专利技术属性】
技术研发人员：高淼，贾晟楠，魏海雷，王泽，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，
类型：发明
国别省市：