用于增强生产的RNA相关酶的修饰制造技术

本发明专利技术尤其提供了使用SUMO

【技术实现步骤摘要】
用于增强生产的RNA相关酶的修饰
[0001]本申请是申请号为201680060626.9、申请日为2016年10月14日、专利技术名称为“用于增强生产的RNA相关酶的修饰”的中国专利技术专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2016/057044的国家阶段申请，该国际申请要求2015年10月14日提交的美国临时专利申请第62/241,350号的优先权。
[0002]相关专利申请
[0003]本专利申请要求于2015年10月14日提交的美国临时申请序列号62/241,350的优先权，所述美国临时申请的公开内容在此以引用的方式并入。
[0004]序列表
[0005]本说明书参考了于2016年10月14日作为命名为“SL_SHR
‑
1187WO”的.txt文件电子提交的序列表。该.txt文件于2016年10月14日生成，并且大小为28,402字节。序列表的全部内容以引用的方式并入本文。

技术介绍

[0006]信使RNA(“mRNA”)疗法正在成为用于治疗各种疾病的越来越重要的方法。有效的mRNA疗法需要将mRNA有效递送给患者，以及由mRN A编码的蛋白质在患者体内的有效产生。为了最佳化mRNA递送和体内蛋白质产生，在构建体的5'末端处通常需要适当的帽，所述帽保护mRNA免于降解并且促进成功的蛋白质翻译。因此，能够给mRNA加帽的酶的大规模生产对于产生用于治疗应用的mRNA特别重要。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供了用于有效生产能够给mRNA加帽的酶的改进方法。本专利技术部分基于下述令人惊讶的发现：用SUMO标签修饰鸟苷酰转移酶(GT)使得以产生用于治疗应用的加帽的mRNA所需的大规模生产GT成为可能。
[0008]因此，在一个方面，本专利技术提供了产生加帽的RNA或RNA类似物寡核苷酸的方法，其中融合蛋白促进将鸟苷酰分子转移至RNA或RNA类似物寡核苷酸的5
’
末端和使鸟苷酰分子甲基化的步骤。
[0009]在一些实施例中，融合蛋白包含鸟苷酰转移酶和小泛素样分子(SUMO)蛋白。在一些实施例中，鸟苷酰转移酶包含SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7，并且SUMO蛋白包含SEQ ID NO:1。在一些实施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:7。
[0010]在一些实施例中，RNA或RNA类似物寡核苷酸的一个末端是5'末端。
[0011]在一些实施例中，相对于野生型鸟苷酰转移酶蛋白，融合蛋白具有可比较的磷酸酶活性、鸟苷酰转移酶活性和甲基化活性。
[0012]在另一个方面，本专利技术提供了融合蛋白，其中融合蛋白包含鸟苷酰转移酶和小泛素样分子(SUMO)蛋白。
[0013]在一些实施例中，鸟苷酰转移酶包含SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7，并且SUMO蛋白包含SEQ ID NO:1。在一些实施例中，鸟苷酰转移酶包含大亚基和小亚基。在一些实施例中，
SUMO蛋白与大亚基共价连接且共表达。在一些实施例中，相对于野生型鸟苷酰转移酶蛋白，融合蛋白具有可比较的磷酸酶活性、鸟苷酰转移酶活性和甲基化活性。
[0014]在另一个方面，本专利技术提供了编码包含鸟苷酰转移酶蛋白和小泛素样分子(SUMO)蛋白的融合蛋白的载体。
[0015]在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:2。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。在一些实施例中，载体包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:3。
[0016]在另一个方面，本专利技术提供了通过发酵生产鸟苷酰转移酶的方法，所述方法包括：a)在发酵培养基中培养用至少一种重组核酸分子转化的微生物，所述重组核酸分子包含编码鸟苷酰转移酶的核酸序列，所述鸟苷酰转移酶具有与SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7至少90％相同的氨基酸序列；和b)收集由培养步骤产生的产物。
[0017]在一些实施例中，鸟苷酰转移酶包含鸟苷酰转移酶融合蛋白。在一些实施例中，相对于野生型鸟苷酰转移酶蛋白，鸟苷酰转移酶融合蛋白具有可比较的磷酸酶活性、鸟苷酰转移酶活性和甲基化活性。在一些实施例中，鸟苷酰转移酶融合蛋白包含小泛素样分子(SUMO)蛋白。在一些实施例中，鸟苷酰转移酶融合蛋白包含SEQ ID NO:8。
[0018]在一些实施例中，SUMO蛋白通过共价键与鸟苷酰转移酶结合。在一些实施例中，共价键在SUMO蛋白和鸟苷酰转移酶的大亚基之间。
[0019]在一些实施例中，发酵培养基选自Terrific Broth、Cinnabar、2xYT和LB。在一些实施例中，微生物是细菌。
[0020]在一些实施例中，编码鸟苷酰转移酶的核酸序列与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3至少90％相同。
[0021]在一些实施例中，重组核酸分子还包含编码小泛素样分子(SUMO)蛋白的核酸序列。在一些实施例中，编码小泛素样分子(SUMO)蛋白的核酸序列与SEQ ID NO:5至少90％相同。
[0022]在一些实施例中，产物是鸟苷酰转移酶。在一些实施例中，产物是包含鸟苷酰转移酶融合蛋白的鸟苷酰转移酶。在一些实施例中，鸟苷酰转移酶融合蛋白还包含小泛素样分子(SUMO)蛋白。
附图说明
[0023]这些附图用于说明的目的并且决不是限制性的。
[0024]图1A和1B是本专利技术的各种实施例中存在的示例性mRNA加帽结构的图解。
[0025]图2证实了与经由摇瓶方法产生的GT蛋白的产率相比，通过发酵产生的可溶性SUMO
‑
GT蛋白的示例性产率。
[0026]定义
[0027]为了使本专利技术更容易理解，首先定义了某些术语。下述术语和其他术语的另外定义在说明书自始至终得到阐述。
[0028]大约：如本文使用的，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指与所述参考值类似的值。在某些实施例中，术语“大约”或“约”指在所述参考值的任一方向上(大于或小于)落入25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、
8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的一系列值，除非另有说明或从上下文另外显而易见(除非当这种数目超过可能值的100％时)。
[0029]分批培养：如本文使用的，术语“分批培养”指培养细胞的方法，其中最终用于培养细胞的所有组分，包括培养基(参见下文“培养基”的定义)以及细胞本身，在培养过程开始时提供。因此，分批培养通常指允许从接种进行到结束的培养，而无需用新鲜培养基给培养的细胞重新补料。分批培养通常在某个点停止，并且收获培养基中的细胞和/或组分且任选进行纯化。
[0030]生物活性的：如本文使用的，短语“生物活性的”指在生物系统(例如细胞培养物、生物等)中具有活性的任何物质的特征。例如，当被施用于生物时，对该本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产生加帽的RNA或RNA类似物寡核苷酸的方法，其中融合蛋白促进将鸟苷酰分子转移至所述RNA或RNA类似物寡核苷酸的5
’
末端和使所述鸟苷酰分子甲基化的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白包含鸟苷酰转移酶和小泛素样分子(SUMO)蛋白。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述鸟苷酰转移酶包含SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7，并且所述SUMO蛋白包含SEQ ID NO:5。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:7。5.根据权利要求1所述的方法，其中相对于野生型鸟苷酰转移酶蛋白，所述融合蛋白具有可比较的磷酸酶活性、鸟苷酰转移酶活性和甲基化活性。6.一种融合蛋白，其中所述融合蛋白包含鸟苷酰转移酶和小泛素样分子(SUMO)蛋白。7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述鸟苷酰转移酶包含SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7，并且所述SUMO蛋白包含SEQ ID NO:5。8.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述鸟苷酰转移酶包含大亚基和小亚基。9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述SUMO蛋白与所述大亚基共价连接且共表达。10.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中相对于野生型鸟苷酰转移酶蛋白，所述融合蛋白具有可比较的磷酸酶活性、鸟苷酰转移酶活性和甲基化活性。11.一种载体，所述载体编码包含鸟苷酰转移酶蛋白和小泛素样分子(SUMO)蛋白的融合蛋白。12.根据权利要求11所述的载体，其中所述载体包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。13.根据权利要求11所述的载体，其中所述载体包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。14.根据权利要求11所述的载体，其中所述载体包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:3。15.一种通过发酵生产鸟苷酰转移酶的方法，所述方法包...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：川斯勒佰尔公司，
类型：发明
国别省市：