一种具有类似纤维粘连蛋白结构域的拟抗体筛选库、其构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及蛋白质类药物筛选系统，具体涉及一种具有类似纤维粘连蛋白结构域的拟抗体筛选库、其构建方法及应用。本发明专利技术提供用于拟抗体筛选的DNA库，由多个DNA分子组成，所述多个DNA分子具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；所述核苷酸序列中的N为A，T，G或C，K为G或T。还提供一种RNA库，是由所述DNA库经转录反应获得。还提供一种拟抗体筛选库，是由所述RNA库经体外无细胞表达获得的RNA

【技术实现步骤摘要】
一种具有类似纤维粘连蛋白结构域的拟抗体筛选库、其构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及蛋白质类药物筛选系统，具体涉及一种具有类似纤维粘连蛋白结构域的拟抗体筛选库、其构建方法及应用。

技术介绍

[0002]拟抗体是一类全新的经蛋白质工程设计合成的结合蛋白，其功能与抗体类似，但结构与之没有任何关系。具有类似纤维粘连蛋白III型结构域的拟抗体大小约为10千道尔顿，可执行和抗体相同的与靶蛋白结合的功能。和当前广泛应用于医药领域的抗体相比，此类拟抗体分子远远小于抗体，更容易穿过人体组织和细胞。拟抗体已成为一类可以替代抗体的用于科研、诊断、治疗等生物医药领域的蛋白质分子。

技术实现思路

[0003]为促进蛋白质类药物研发，我们构建了一种具有类似纤维粘连蛋白结构域的拟抗体筛选库，基于核糖体展示技术和RNA展示技术进行拟抗体筛选，经过4至7个循环可获得高效及特异结合靶蛋白质的拟抗体。
[0004]本专利技术提供一种用于拟抗体筛选的DNA库，由多个DNA分子组成，其特征在于：所述多个DNA分子具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；所述核苷酸序列中的N为A，T，G或C，K为G或T。
[0005]在本专利技术的一些实施例中，所述多个DNA分子的5
’
端还包含T7噬菌体RNA聚合酶启动子序列和核糖体结合位点序列，3
’
端还包含用于连接嘌呤霉素连接体的链接DNA序列和终止密码子。
[0006]在本专利技术的一些实施例中，所述多个DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述核苷酸序列中的N为A，T，G或C，K为G或T。
[0007]在本专利技术的一些实施例中，所述DNA库的DNA多样性为20
34
(1.7
×
10
44
)。
[0008]本专利技术还提供一种用于拟抗体筛选的RNA库，其特征在于：是由任一所述的DNA库经转录反应获得。
[0009]本专利技术还提供一种拟抗体筛选库，其特征在于：是由所述RNA库经体外无细胞表达获得的RNA
‑
拟抗体库，或者由所述RNA
‑
拟抗体库经反转录获得的cDNA
‑
拟抗体库。
[0010]本专利技术还提供包含任一所述的DNA库或所述的RNA库或所述的拟抗体筛选库的试剂盒。
[0011]在本专利技术的一些实施例中，所述试剂盒还包含用于拟抗体筛选的通用试剂；所述通用试剂包括PCR试剂、DNA提取与纯化试剂、体外转录试剂、RNA提取与纯化试剂、体外无细胞表达试剂，和/或反转录试剂。所述PCR试剂包括普通PCR试剂和定量PCR试剂。PCR使用的聚合酶优选高保真DNA聚合酶，可保证长链DNA的高准确扩增，不推荐使用Taq。为了最大程度提取出含不同序列的DNA库，不推荐使用商用DNA提取试剂盒。
[0012]任一所述的DNA库或所述的RNA库或所述的拟抗体筛选库或所述的试剂盒在拟抗体筛选中的应用也属于本专利技术的保护范围。
[0013]本专利技术还提供一种拟抗体筛选库的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
[0014]1)合成任一所述的DNA库；
[0015]2)以所述DNA库为模板，合成RNA库；
[0016]3)将所述RNA库与嘌呤霉素连接体连接，获得嘌呤霉素连接体
‑
RNA库；
[0017]4)以所述嘌呤霉素连接体
‑
RNA库为模板进行体外无细胞表达，获得RNA
‑
拟抗体库；
[0018]5)以所述RNA
‑
拟抗体库为模板进行反转录，获得拟抗体筛选库。
[0019]在本专利技术的一些实施例中，步骤1)中，通过两步重叠PCR反应合成DNA库；第一步PCR反应使用核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物；第二步PCR反应使用核苷酸序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的引物；引物中的N为A，T，G，C的等摩尔混合物，K为G，T的等摩尔混合物；步骤3)中，所述嘌呤霉素连接体由SEQ ID NO:8所示的寡核苷酸经5
’
端修饰PO4，3
’
端修饰嘌呤霉素，并在第16个碱基和第17个碱基之间并入连续的6个六乙二醇而获得。
[0020]本专利技术还提供一种筛选针对靶蛋白质的拟抗体的方法，使用所述的拟抗体筛选库针对靶蛋白质进行拟抗体筛选。
[0021]在本专利技术的一些实施例中，所述方法包括如下步骤：
[0022]1)制备和纯化靶蛋白质，将靶蛋白质固定在固相载体上；
[0023]2)制备所述的RNA库；
[0024]3)将RNA库与嘌呤霉素连接体相连，获得嘌呤霉素连接体
‑
RNA库；
[0025]4)以嘌呤霉素连接体
‑
RNA库为模板进行体外无细胞表达，然后解离核糖体复合物，获得RNA
‑
拟抗体库；
[0026]5)以RNA
‑
拟抗体库为模板进行反转录，获得cDNA
‑
拟抗体库；
[0027]6)将固定有靶蛋白质的固相载体与cDNA
‑
拟抗体库一起孵育，然后洗去未结合的cDNA
‑
拟抗体，作为筛选样本；将不含靶蛋白质的固相载体与cDNA
‑
拟抗体库一起孵育，然后洗去未结合的cDNA
‑
拟抗体，作为对照样本；
[0028]7)向步骤6)得到的样本中加入洗脱液，获得筛选的cDNA；
[0029]8)以筛选的cDNA为模板，转录获得RNA库，然后重复步骤3)－7)，进行下一个筛选循环；
[0030]9)以步骤5)获得的cDNA
‑
拟抗体库为模板进行定量PCR，得到原始DNA量；以步骤7)获得的cDNA为模板进行定量PCR，得到筛选样本和对照样本的DNA量；按照样本DNA量/原始DNA量计算每个筛选循环中筛选样本和对照样本的DNA回收率；若筛选样本C
T
值逐渐小于对照样本C
T
值且筛选样本的DNA回收率逐渐增加且越来越大于对照样本的DNA回收率，则表明筛选样本中存在能与靶蛋白质结合的拟抗体，然后通过DNA测序确定筛选得到的拟抗体。
[0031]在本专利技术的一些实施例中，所述固相载体为带有标签的磁珠，并且所述靶蛋白质含有能与所述磁珠相结合的标签。
[0032]在本专利技术的一些实施例中，所述嘌呤霉素连接体由SEQ ID NO:8所示的寡核苷酸经5
’
端修饰PO4，3
’
端修饰嘌呤霉素，并在第16个碱基和第17个碱基之间并入连续的6个六
乙二醇而获得。
[0033]在本专利技术的一些实施例中，步骤9)中，使用核苷酸序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的引物进行定量PCR。
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于拟抗体筛选的DNA库，由多个DNA分子组成，其特征在于：所述多个DNA分子具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；所述核苷酸序列中的N为A，T，G或C，K为G或T。2.根据权利要求1所述的DNA库，其特征在于：所述多个DNA分子的5
’
端还包含T7噬菌体RNA聚合酶启动子序列和核糖体结合位点序列，3
’
端还包含用于连接嘌呤霉素连接体的链接DNA序列和终止密码子。3.根据权利要求1所述的DNA库，其特征在于：所述多个DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述核苷酸序列中的N为A，T，G或C，K为G或T。4.根据权利要求1所述的DNA库，其特征在于：所述DNA库的DNA多样性为20
34
。5.一种用于拟抗体筛选的RNA库，其特征在于：是由权利要求1
‑
4任一所述的DNA库经转录反应获得。6.一种拟抗体筛选库，其特征在于：是由权利要求5所述的RNA库经体外无细胞表达获得的RNA
‑
拟抗体库，或者由所述RNA
‑
拟抗体库经反转录获得的cDNA
‑
拟抗体库。7.包含权利要求1
‑
4任一所述的DNA库或权利要求5所述的RNA库或权利要求6所述的拟抗体筛选库的试剂盒。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含用于拟抗体筛选的通用试剂；所述通用试剂包括PCR试剂、DNA提取与纯化试剂、体外转录试剂、RNA提取与纯化试剂、体外无细胞表达试剂，和/或反转录试剂。9.一种拟抗体筛选库的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：1)合成权利要求1
‑
4任一所述的DNA库；2)以所述DNA库为模板，合成RNA库；3)将所述RNA库与嘌呤霉素连接体连接，获得嘌呤霉素连接体
‑
RNA库；4)以所述嘌呤霉素连接体
‑
RNA库为模板进行体外无细胞表达，获得RNA
‑
拟抗体库；5)以所述RNA
‑
拟抗体库为模板进行反转录，获得拟抗体筛选库。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤1)中，通过两步重叠PCR反应合成DNA库；第一步PCR反应使用核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物；第二步PCR反应使用核苷酸序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的引物；引物中的N为A，T，G，C的等摩尔混合物，K为G，T的等摩尔混合物；步骤3)中，所述嘌呤霉素连接体由SEQ ID NO:8所示的寡核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：李永琦，
申请(专利权)人：北京创智智能健康技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：