一种HCV四受体转基因合并STAT1敲除小鼠的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体转基因合并CRISPR/Cas9技术构建STAT1基因敲除小鼠(简称4hEF

【技术实现步骤摘要】
一种HCV四受体转基因合并STAT1敲除小鼠的制备方法


[0001]本专利技术涉及转基因和基因编辑
，特别涉及一种CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体转基因合并CRISPR/Cas9技术构建STAT1基因敲除小鼠(简称4hEF
Tg STAT1
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小鼠)的构建方法及应用。

技术介绍

[0002]丙型肝炎病毒(HCV)是经血液传播病毒，感染人类后易慢性化。病毒的持续存在可使肝炎向肝脂肪病变、肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌进展，严重威胁人类健康。在世界范围，据估计，2015年全球病毒性丙型肝炎的患病率为1.0％(95％的不确定区间为0.8
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1.1)，有7100万(62.5
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79.4)为慢性病毒性感染。目前尚无HCV疫苗，而疫苗研发难点除了HCV基因组差异大，不同基因型的病毒序列差异可高达50％{Bukh,1995#111}{Simmonds,2005#112}，在感染机体内常以准种形式存在外，目前缺乏合适的动物模型也限制了HCV疫苗的研发应用。
[0003]HCV自然宿主是人和黑猩猩，由于灵长类动物费用高和伦理问题复杂，限制了该类动物的应用。近几年，国内外学者已经在小型动物模型上进行各种尝试，已取得部分进展，主要有：
[0004](1)树鼩模型：树鼩对HCV易感，一些动物在初次感染3年后疾病可进展成肝纤维化和肝硬化{Amako,2010#155}。但树鼩属于野生动物，遗传品系不稳定，应用受限。
[0005](2)HCV基因转基因小鼠模型：可表达表达HCV基因单个蛋白组分产物或基因多个蛋白组合产物，但会由于表达HCV产物的不同、小鼠背景的差异性或HCV蛋白表达所用启动子不同而出现组织病理报告差异大，表现为不同程度的肝疾病，使针对发病机制研究时需要多加注意。
[0006](3)异种移植小鼠模型：通过将人肝细胞(如肝癌细胞系或者原代肝细胞)移植入小鼠体内，形成人肝移植小鼠。该类小鼠模型免疫缺陷，不能用于研究宿主抗HCV的特异性适应性免疫反应和再现病毒整个生命周期。
[0007](4)宿主因子人源化小鼠模型：在HCV感染人体过程中有四个(CD81、SCARB1、CLDN1和OCLN)入侵必需宿主因子，其中CD81第二个包外环关键氨基酸残基和OCLN分子是阻止HCV入侵啮齿动物细胞的原因。利用腺病毒瞬时表达人CD81单分子或同时表达人CD81、SCARB1、OCLN和CLDN1四种分子的小鼠模型却并未成功建立HCV感染{Masciopinto,2002#191}{Hikosaka,2011#192}。在近交鼠上同时稳定表达人CD81和OCLN分子能使HCV成功入侵，但小鼠的免疫系统限制了HCV的感染{Dorner,2011#194}，在此基础上敲除STAT1
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，该小鼠能成功建立HCV感染，并能激活适应性免疫反应。

技术实现思路

[0008]本专利技术为解决现有丙型肝炎病毒感染小鼠模型缺乏，目的在于提供了一种构建CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体转基因合并STAT1基因敲除小鼠的制备方法。
[0009]本专利技术另一目的在于通过本专利技术方法制备的动物模型用于HCV疫苗探索研究的模型基础。
[0010]本专利技术采用的技术方案包括以下具体步骤：
[0011](1)将人CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体基因合成后，插入同一pFUW
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CSCO载体核酸内切酶NdeI酶切位点，获得pFUW
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CSCO
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4hEF表达载体。
[0012]其中构建的pFUW
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CSCO
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4hEF表达载体含人UBC启动子，可用于转基因在小鼠体内广泛表达。
[0013]将pFUW
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CSCO
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4hEF表达载体DNA经NdeI内切酶消化，得到含该基因的线性化DNA片段；CD81、CLDN1、OCLN、SRB1编码DNA序列分别为SEQ ID:1、SEQ ID:2、SEQ ID:3和SEQ ID:4；
[0014]将DNA片段经显微注射入ICR小鼠受精卵；
[0015]受精卵移植入ICR假孕雌鼠子宫；
[0016]小鼠出生后，设计2对特异性引物，经基因组PCR方法鉴定，获得CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体转基因ICR子代小鼠(简称4hEF
Tg
)；
[0017]PCR特异性引物序列如下：
[0018]Primer1：
[0019]F：5
’
CGGAACAGGCGAGGAAAAGT(SEQ ID:5)
[0020]R：5
’
ACAAAACACACTCGCCAACC(SEQ ID:6)
[0021]Primer2：
[0022]F：5
’
CCTGTCATCTGCCAAATCCG(SEQ ID:7)
[0023]R：5
’
TACTGATCCACGTAGAGTCCA(SEQ ID:8)
[0024](2)针对STAT1基因第一外显子和第二外显子序列，设计2对sgRNA序列，通过构建STAT1基因敲除载体并体外转录获得sgRNA
[0025]在NCBI上查询小鼠STAT1基因信息，根据靶点序列和脱靶位点、发生错配可能性大小进行设计和评估筛选，核苷酸序列和由公司合成的sgRNA序列如下所示；
[0026]位点1：ACTCCAAGTTCCTGGAGC AGG(SEQ ID:9)
[0027]sgRNA序列：
[0028]M
‑
STAT1
‑
gRNA
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UP1 5
’
ATGGACTCCAAGTTCCTGGAGC(SEQ ID:10)
[0029]M
‑
STAT1
‑
GRNA
‑
DOWN1 5
’
AAACGCTCCAGGAACTTGGAGT(SEQ ID:11)
[0030]位点2：CCT CCTCTCACAGCTGGACGA(SEQ ID:12)
[0031]sgRNA序列：
[0032]M
‑
STAT1
‑
gRNA
‑
UP2 5
’
ATGGTCGTCCAGCTGTGAGAGG(SEQ ID:13)
[0033]M
‑
STAT1
‑
GRNA
‑
DOWN2 5
’
AAACCCTCTCACAGCTGGACGA(SEQ ID:14)
[0034]合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体转基因合并CRISPR/Cas9技术构建STAT1基因敲除小鼠的构建方法，其特征在于：(1)CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受体转基因小鼠构建；将pFUW
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CSCO
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4hEF表达质粒酶切；得到线性化DNA片段显微注射入ICR小鼠受精卵，植入假孕小鼠子宫内；子鼠出生后经基因组PCR方法鉴定基因型，获得阳性4hEF
Tg
小鼠；(2)STAT1敲除小鼠构建；针对STAT1基因第一外显子和第二外显子序列，设计2对sgRNA序列，通过构建STAT1基因敲除载体并体外转录获得sgRNA；合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSAⅠ线性化的pUC57
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sgRNA载体，通过体外转录成为可注射的sgRNA；pST1374
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NLS
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flag
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linker
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Cas9载体通过体外转录成为可注射的Cas9
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RNA。经显微注射入I...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨威，林田莉，李端，
申请(专利权)人：中国医学科学院病原生物学研究所，
类型：发明
国别省市：