本发明专利技术公开了灵芝多糖的发酵提取方法、灵芝多糖组合物及其应用，本发明专利技术所述的灵芝多糖的发酵提取方法，首先利用枯草芽孢杆菌进行发酵，枯草芽孢杆菌能产生多种纤维素酶和蛋白酶，从而促进子实体的细胞壁快速瓦解，快速释放细胞壁上以及胞内的包含灵芝多糖在内的大量胞内活性成分；然后，将枯草芽孢杆菌发酵剩余的残渣进行再利用，具体采用酿酒酵母菌将残渣中未降解的大分子多糖进行降解，对残渣进行二次利用且转化出更多种类的小分子灵芝多糖；最后，将酿酒酵母菌发酵剩余的二次残渣进行最后的发酵利用，具体采用乳酸菌属的菌株将二次残渣中的未降解成分进行发酵，可产乳酸，且有提高发酵产物保湿嫩肤功效的作用。提高发酵产物保湿嫩肤功效的作用。提高发酵产物保湿嫩肤功效的作用。
【技术实现步骤摘要】
灵芝多糖的发酵提取方法、灵芝多糖组合物及其应用
[0001]本专利技术涉及及天然药物化学领域和化妆品领域，特别是涉及灵芝多糖的发酵提取方法、灵芝多糖组合物及其应用。
技术介绍
[0002]灵芝是从孢子萌发，经过单核的初级菌丝至双核的次级菌丝和三级菌丝继而形成子实体。灵芝孢子内含有丰富的多糖肽、腺嘌呤核苷、蛋白质、酶、三萜类、有机锗、微量元素等特殊成分。灵芝菌丝体的化学成分主要是蛋白质、核酸、碳水化合物、脂类及各种无机盐类。灵芝子实体包含孢子和菌丝体的所有的营养成分，营养成分丰富，且比市售孢子粉价格低，经济效益高，极具有研究价值。
[0003]灵芝多糖是灵芝的主要活性成分之一，国内外学者发现的灵芝多糖有200多种，主要以杂多糖形式存在，其中绝大多数是β
‑
葡聚糖，天然的β
‑
葡聚糖被认为是一种功能性多糖，有抗氧化、抗皱、抗紫外线和保湿等活性，经常用于化妆品中。但灵芝细胞壁非常坚硬，会限制灵芝多糖的充分溶出。灵芝细胞壁的结构可分为四层，由外到内依次是β
‑
葡聚糖、糖蛋白、蛋白质、几丁质微丝等，借助有效手段破壁，可助于灵芝多糖的溶出。
[0004]目前灵芝多糖的提取方法有热水浸提法、微波辅助提取法、酶解法、超声提取等方法，但普遍存在杂质含量高，操作麻烦，易破坏提取物活性影响药效发挥且损耗较大、破壁不完全导致提取量有限等局限性。
[0005]微生物转化对生物活性物质的提取作用更温和，能够最大程度保留被提取物中的天然活性成分，降低毒副作用，同时微生物在代谢过程中产生的多种活性酶达到增效的作用，因此采用微生物发酵技术提取灵芝多糖，具有原料利用率高和技术温和等优点，已成为植物来源的化妆品原料研发热点，但是现有技术中公开的微生物发酵技术多运用单一菌种发酵，其中，单一菌种发酵代谢产物不够丰富、原料利用率不高。
技术实现思路
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：本专利技术提供了一种灵芝多糖的发酵提取方法和灵芝多糖组合物及其应用，本专利技术采用逐级发酵的方式对灵芝子实体进行处理，选用枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和植物乳酸杆菌三种益生菌，首先利用枯草芽孢杆菌产酶特性充分瓦解细胞壁，其次利用酿酒酵母菌降解大分子多糖，最后利用植物乳酸杆菌产酸的特性提高生物活性，每一步发酵条件易于控制和调节，且对底物顺序发酵多次，有助于获取更多的小分子多糖。
[0007]本专利技术所采用的技术方案是：
[0008]第一方面，本专利技术提供了一种灵芝多糖的发酵提取方法，图1a所示，所述提取方法由包括以下步骤的方法制得：
[0009]①
将发酵底物加10～20倍重量的无菌水，混合均匀，作为半固体发酵培养基，所述发酵底物可以为灵芝子实体初步研磨或机械破壁形成的絮状粗粉、也可以是灵芝原料包括
灵芝子絮状粗粉或孢子粉进一步破壁处理后形成的粘稠絮状物；
[0010]②
进行一次发酵纯化处理，所述一次发酵纯化处理过程包括：将活化后的枯草芽孢杆菌按接种至半固体发酵培养基中，在空气通风条件下，30℃～37℃温度下恒温摇瓶发酵12～72h，抽滤获取滤液，滤液离心取上清液，上清液去蒸发浓缩冻干保存记为一次发酵灵芝粗提取物，培养基中的剩余药渣高压蒸汽灭菌终止发酵；对一次发酵灵芝粗提取物进行纯化处理，获得一次发酵纯化多糖组合物；
[0011]③
进行二次发酵纯化，所述二次发酵纯化处理过程包括：将活化后的酿酒酵母菌接种至培养基中，在空气通风条件下，30℃～37℃下恒温摇瓶发酵12～72h，抽滤获取滤液，滤液离心取上清液，上清液去蒸发浓缩冻干保存记为二次发酵灵芝粗提取物；药渣高压蒸汽灭菌终止发酵；二次发酵灵芝粗提取物进行纯化处理，获得二次发酵纯化多糖组合物；
[0012]④
进行三次发酵纯化，所述三次发酵纯化处理过程包括：将活化后的乳酸菌属的菌株接种至培养基中，在空气通风条件下，30～37℃温度下静置发酵培养12～72h，抽滤获取滤液，滤液离心取上清液，上清液去蒸发浓缩冻干保存记为三次发酵灵芝粗提取物；三次发酵灵芝粗提取物进行纯化处理，获得三次发酵纯化多糖组合物；
[0013]其中，所述步骤
②
、步骤
③
和步骤
④
中的纯化处理过程均包括：脱脂、脱蛋白和醇沉的步骤。
[0014]优选的，步骤
②
和步骤
③
中，所述药渣高压蒸汽灭菌终止发酵具体操作为121℃高压蒸汽灭菌15min终止发酵；
[0015]优选的，步骤
②
和步骤
③
中，所述摇瓶发酵的转速均为200r/min；
[0016]优选的，步骤
②
、步骤
③
和步骤
④
中，所述滤液离心的转速均为8000r/min，时间均优选为30min；
[0017]优选的，步骤
②
、步骤
③
和步骤
④
的纯化处理过程中，所述脱脂过程包括：加95％乙醇，涡旋3min，10000r/min离心5min，弃上清液，重复操作3～5次；
[0018]优选的，步骤
②
、步骤
③
和步骤
④
的纯化处理过程中，所述脱蛋白过程包括：一步沉淀挥干，加水和Sevag试剂，每1mL水配置250μL Sevag试剂，涡旋10min，10000r/min离心2min，重复操作5～8次，直至无沉淀出现；
[0019]优选的，步骤
②
、步骤
③
和步骤
④
的纯化处理过程中，所述醇沉过程包括：二步水相挥干有机溶剂，每200μL水相加800μL无水乙醇，4℃条件下放置12
‑
16h，12000r/min离心10min，弃上清液，沉淀50℃烘干。
[0020]优选的，所述枯草芽孢杆菌活化过程包括：将枯草芽孢杆菌以1:100的比例接到枯草芽孢杆菌专用液体培养基中，30℃，200r/min转速下恒温摇瓶15～24h，600nm测得OD值约为1.2时，得到枯草芽孢杆菌液体种子，所述枯草芽孢杆菌专用液体培养基由MEB培养基溶于蒸馏水配置而成。
[0021]优选的，所述酿酒酵母菌的活化过程包括：将酿酒酵母菌以1:100的比例接到100mL的MEB液体培养基中，30℃，200r/min转速下恒温摇瓶24h，600nm测得OD值约为1.2时，得到酿酒酵母液体种子；
[0022]进一步的，所述乳酸菌属的菌株包括但不仅限于植物乳杆菌，优选的，所述植物乳杆菌的活化过程包括：将乳酸杆菌以1:100的比例接到100mL MRS液体培养基中，30～37℃条件下恒温培养10～15h，600nm测得OD值约为1.7时，得到乳酸杆菌液体种子。
[0023]相应的，第二方面，本专利技术还提供由上述提取方法获得灵芝多糖组合物，所述灵芝多糖组合物为上述提取方法中获得的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种灵芝多糖的发酵提取方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
①
将发酵底物加10～20倍重量的无菌水，混合均匀，作为半固体发酵培养基，所述发酵底物为灵芝子实体初步研磨或机械破壁形成的絮状粗粉或灵芝原料进一步破壁处理后形成的粘稠絮状物；
②
进行一次发酵纯化处理，所述一次发酵纯化处理过程包括：将活化后的枯草芽孢杆菌按接种至半固体发酵培养基中，在空气通风条件下，30℃～37℃温度下恒温摇瓶发酵12～72h，抽滤获取滤液，滤液离心取上清液，上清液浓缩冻干保存记为一次发酵灵芝粗提取物，培养基中的剩余药渣高压蒸汽灭菌终止发酵；对一次发酵灵芝粗提取物进行纯化处理，获得一次发酵纯化多糖组合物；
③
进行二次发酵纯化，所述二次发酵纯化处理过程包括：将活化后的酿酒酵母菌接种至培养基中，在空气通风条件下，30℃～37℃下恒温摇瓶发酵12～72h，抽滤获取滤液，滤液离心取上清液，上清液浓缩冻干保存记为二次发酵灵芝粗提取物；药渣高压蒸汽灭菌终止发酵；二次发酵灵芝粗提取物进行纯化处理，获得二次发酵纯化多糖组合物；
④
进行三次发酵纯化，所述三次发酵纯化处理过程包括：将活化后的乳酸菌属的菌株接种至培养基中，在空气通风条件下，30～37℃温度下静置发酵培养12～72h，抽滤获取滤液，滤液离心取上清液，上清液浓缩冻干保存记为三次发酵灵芝粗提取物；其中，所述步骤
②
、步骤
③
和步骤
④
中的纯化处理过程均包括：脱脂、脱蛋白和醇沉的步骤。2.根据权利要求1所述的一种灵芝多糖的发酵提取方法，其特征在于：步骤
②
和步骤
③
中，所述摇瓶发酵的转速均为200r/min。3.根据权利要求1所述的一种灵芝多糖的发酵提取方法，其特征在于：步骤
②
、步骤
③
和步骤
④
的纯化处理过程中，所述脱脂过程包括：加95％乙醇，涡旋3min，10000r/min离心5min，取沉淀重复离心3～5次，弃上清液。4.根据权利要求1所述的一种灵芝多糖...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴建新，黄庆，柴娜，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：
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