本发明专利技术公开了大口黑鲈Nesfatin
【技术实现步骤摘要】
大口黑鲈Nesfatin
‑
1蛋白及其原核表达方法与应用
[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及大口黑鲈Nesfatin
‑
1蛋白及其原核表达方法与应用。
技术介绍
[0002]近年来，鲈鱼养殖模式从投喂冰鲜小鱼转变为人工配合饲料，由于养殖模式、饲料配方及养殖水环境的影响，养殖鲈鱼体脂含量会大量沉积，致使机体组织器官受损，抑制鱼类生长，甚至引起死亡。研究显示当脂肪达到一定水平易损伤大口黑鲈肝功能。
[0003]Nesfatin
‑
1是核连蛋白2(NUCB2)基因编码的由82个氨基酸组成的厌食肽。研究显示Nesfatin
‑
1是NUCB2的功能核心片段，主要参与能量代谢调节，其生物学功能广泛，如
①
通过中枢作用以及外周血脑屏障和钙离子通道机制引起厌食作用：
②
通过T型Ca
2+
通道引起DMNV神经元Ca
2+
内流兴奋体内传出迷走神经，抑制胃酸分泌，胃动力减弱；
③
降低血糖，抑制肝脏中糖异生限速酶，从而提高机体对胰岛素的敏感性；
④
通过抑制食欲、能量消耗、以及抑制脂肪细胞的分化等起到对脂肪代谢的调节作用。
⑤
中枢作用响应应激的发生；
⑥
在繁殖方面主要参与发育期的启动。天然的Nesfatin
‑
1蛋白存在于多种器官组织中，以肝脏中的含量最丰富，但分离纯化出组织中的大口黑鲈Nesfatin
‑
1蛋白技术难度较大，而化学合成成本过高，因此利用基因工程技术制备重组大口黑鲈Nesfatin
‑
1蛋白是解决上述问题的一个有效途径。市场上多是针对人、大鼠和小鼠Nesfatin
‑
1的抗体，但是针对大口黑鲈Nesfatin
‑
1蛋白高滴度、高特异性的抗体目前没有报道。
[0004]大肠杆菌原核表达系统进行诱导表达的重组蛋白大多是以包涵体形式存在，而可溶性蛋白仅为总表达蛋白的13.3％
‑
23％，无法大量表达可溶性蛋白。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是提供大口黑鲈Nesfatin
‑
1蛋白及其原核表达方法与应用。
[0006]本专利技术另一目的是提供利用原核表达系统生产的重组Nesfatin
‑
1蛋白制备出效价高、特异性好的多克隆抗体的方法。
[0007]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种大口黑鲈Nesfatin
‑
1蛋白，包含如下的氨基酸序列或由其组成：
[0008]i)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或
[0009]ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或
[0010]iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。
[0011]第二方面，本专利技术提供编码大口黑鲈Nesfatin
‑
1蛋白的核酸分子，序列如SEQ ID NO：2所示。
[0012]第三方面，本专利技术提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
[0013]第四方面，本专利技术提供大口黑菌Nesfatin
‑
1蛋白的原核表达方法，包括以下步骤：
[0014](1)提取大口黑鲈肝胰脏组织总RNA；
[0015](2)设计用于扩增大口黑鲈Nesfatin
‑
1基因的引物Nesfatin
‑1‑
F和Nesfatin
‑1‑
R；
[0016](3)RT
‑
PCR的扩增：将总RNA逆转录成cDNA，以cDNA作为模板，利用引物Nesfatin
‑1‑
F和Nesfatin
‑1‑
R进行PCR扩增；
[0017](4)将步骤(3)得到的PCR扩增产物构建到原核表达载体中，用所得重组表达载体转化大肠杆菌，得到转化子；
[0018](5)IPTG诱导表达目的蛋白，离心收集菌体；
[0019](6)超声破碎菌体细胞，用含His标签的镍亲和层析柱对目的蛋白进行纯化。
[0020]优选地，步骤(2)中所述引物Nesfatin
‑1‑
F和Nesfatin
‑1‑
R的核苷酸序列分别如下(SEQ ID NO：3
‑
4)：
[0021]Nesfatin
‑1‑
F：5
’‑
CCCGAATTC(EcoR I酶切位点)ATGGTGCCCATCAGTATGG
‑3’
[0022]Nesfatin
‑1‑
R：5
’‑
CCGCTCGAG(Xho I酶切位点)GCTACAACTCATCCAGTTTTG
‑3’
[0023]优选地，步骤(4)中所述原核表达载体为pET系列载体，如pET
‑
32a(+)、pET
‑
28a、pET
‑
30a等，更优选pET
‑
32a(+)。
[0024]优选地，步骤(5)中IPTG的终浓度为0.2mmol/L。
[0025]优选地，步骤(6)中依次用10、40、80、100mmol/L咪唑洗脱镍亲和层析柱，洗脱下的目的蛋白用透析液复性。
[0026]所述透析液为：氯化钠140mmol/L、氯化钾2.7mmol/L、十二水磷酸氢二钠10mmol/L、磷酸二氢钾1.8mmol/L，pH8.0。
[0027]第五方面，本专利技术提供抗大口黑鲈Nesfatin
‑
1蛋白特异性抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。
[0028]所述多克隆抗体是以大口黑鲈Nesfatin
‑
1蛋白作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物制备得到。
[0029]所述单克隆抗体是以大口黑鲈Nesfatin
‑
1蛋白作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，采用杂交瘤技术或DNA重组技术制备得到。
[0030]第六方面，本专利技术提供所述抗体在制备大口黑鲈Nesfatin
‑
1蛋白检测试剂或试剂盒中的应用。
[0031]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0032]本专利技术首次利用大肠杆菌原核表达系统表达出Nesfatin
‑
1蛋白，分子量约为30kDa，诱导表达时间为4h，最佳浓度0.2mmol/L，成功实现大口黑鲈Nesfatin
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1蛋白的大量可溶性表达；利用镍柱亲和层析法分离得到了较纯的可溶性重组蛋白，且浓度达本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.大口黑鲈Nesfatin
‑
1蛋白，其特征在于，包含如下的氨基酸序列或由其组成：i)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子。3.含有权利要求2所述核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。4.权利要求1所述蛋白的原核表达方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取大口黑鲈肝胰脏组织总RNA；(2)设计用于扩增权利要求2所述核酸分子的引物Nesfatin
‑1‑
F和Nesfatin
‑1‑
R；(3)RT
‑
PCR的扩增：将总RNA逆转录成cDNA，以cDNA作为模板，利用引物Nesfatin
‑1‑
F和Nesfatin
‑1‑
进行PCR扩增；(4)将步骤(3)得到的PCR扩增产物构建到原核表达载体中，用所得重组表达载体转化大肠杆菌，得到转化子；(5)IPTG诱导表达目的蛋白，离心收集菌体；(6)超声破碎菌体细胞，用含His标签的镍亲和层析柱对目的蛋白进行纯化。5.根据权利要求4所述的方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏时萍，刘帆，刘鑫鑫，陈芳芳，李西雷，张君，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：
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