通过外泌体miRNA标志物鉴定结直肠癌状态的检测试剂盒和方法技术

本文提供了用于在受试者中进行结直肠癌状态诊断的检测试剂盒，其包括用于检测来自所述受试者的生物样品中miRNA生物标志物水平的检测试剂，所述miRNA生物标志物选自hsa

【技术实现步骤摘要】
通过外泌体miRNA标志物鉴定结直肠癌状态的检测试剂盒和方法


[0001]本专利技术属于基因工程及肿瘤学领域，具体涉及与结直肠癌辅助诊断相关的外泌体miRNA 标志物及其应用。

技术介绍

[0002]结直肠癌是威胁我国和全世界人民生命健康的主要癌症之一，造成了严重的社会负担。世 界卫生组织下属的国际癌症研究机构(IARC)发布最新的《2020全球癌症报告》显示，2020 年全球新发癌症病例1929万例，其中中国新发癌症457万人，占全球的23.7％。2020年结 直肠癌的全球新发数量为193万，仅次于乳腺癌和肺癌。在中国，2020年结直肠癌的新发数 量为56万，已经成为仅次于肺癌的第二大癌种。随着人口老龄化的加剧，预计2040年癌症 负担将增加50％，届时全国新发癌症病例数将达到近3000万，且该趋势在正经历社会和经 济转型的国家中最为显著。结直肠癌的发生发展大多遵循“腺瘤—癌”序列，从癌前病变进展 到癌一般需要5～10年的时间，为疾病的早期诊断和临床干预提供了重要时间窗口。此外，结 直肠癌的预后与诊断分期紧密相关。Ⅰ期结直肠癌的5年相对生存率为90％，而发生远处转移 的Ⅳ期结直肠癌5年相对生存率仅为14％。大量的研究和实践已经表明结直肠癌筛查和早诊早 治可以有效降低结直肠癌的死亡率。
[0003]结肠镜检查在结直肠癌筛查中占据独特而不可替代的地位，是整个结直肠癌筛查流程的核 心环节，结肠镜下活检切除标本的病理检查是结直肠癌确诊的金标准，镜下切除癌前病变可降 低结直肠癌的发病率和死亡率。结肠镜可直接观察到结直肠腔内壁，是发现肠道肿瘤最敏感的 方法，但结肠镜检查仍有一定漏诊率，主要发生在近端结肠，以锯齿状息肉和平坦腺瘤为主。 获得良好的肠道准备，进行规范的结肠镜操作和精细耐心的镜下观察是降低病变漏诊率的重要 措施，所以，结肠镜检查对受检者和内镜医师都有较高要求。由于结肠镜检查前需要进行饮食 限制和严格的肠道清洁准备，未接受镇静或麻醉结肠镜检查的部分受检者需承受较大痛苦，导 致其依从性不佳。另外，结肠镜检查的直接与间接费用也会影响人群参与筛查的意愿；而且结 肠镜检查属于侵入性检查、有一定的并发症发生率，目标人群常由于畏惧而拒绝结肠镜检查。 国内外研究数据显示，即使是粪便隐血试验阳性，随后进行结肠镜检查的比例也仅有30％～40％。 CT、PET
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CT、MRI、超声等都是结直肠癌在影像学方面的常规检测方法，相较于结肠镜，结 直肠癌的影像学检查具有非侵入性、方便快捷等优点，待测人员的检测依从性也较高，但此类 方法对患者查前准备及医师技术的要求严格，同时存在假阳性、放射线危害等问题。由于影像 学检查自身的局限性，很难满足大规模筛查的迫切需求，随着分子生物学领域研究的深入，人 们开始将目光转移向结直肠癌早期诊断的分子标志物。血浆Septin9基因甲基化检测以及粪便 丙酮酸激酶(M2
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PK)检测是目前应用较广的结直肠癌分子学筛查方法，最近我国一项大规模 临床试验发现血浆Septin9基因甲基化检测诊断结直肠癌的敏感性和特异性分别为74.8％和 87.4％，均高于FIT检测。但mSEPT9对于癌前病变(结直肠腺瘤及息肉、进展期腺瘤)的诊 断敏感性和
特异性不足，不推荐用于人群筛查，可作为个体化诊断的选择与补充。
[0004]外泌体(Exosome)是由活细胞分泌的直径约为30
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150nm的小囊泡，广泛分布于人的多种 体液中。来源于不同组织的外泌体不仅具有其特异性蛋白分子，还包含其行使功能的关键分子。 外泌体由细胞分泌释放出来，在血液等体液内传播，之后又可被其他细胞吞噬，是细胞间通讯 的重要介质。研究表明外泌体在肿瘤发生、侵袭及转移等过程中发挥重要作用。
[0005]miRNA是在真核生物中发现的一类内源性的具有转录后调控功能的非编码RNA，长度通 常为19
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25个核苷酸。作为一类小的非编码单链RNA，其可以通过与相应的3'
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非翻译区(3'
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UTR) 或开放阅读框结合来沉默靶标mRNA。大量研究表明，miRNA参与调控了包括免疫防御、免 疫监视、免疫稳态以及肿瘤发生发展在内的多种生理过程，因此许多循环miRNA已被用于肿 瘤的诊断、预后和治疗。2008年美国研究者首次报道了循环miRNA有潜力成为实体瘤的新型 标志物，后续有研究评估了粪便样本中miR
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21和miR
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92a在区分结直肠癌与结直肠息肉方面 的可行性，发现miR
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21和miR
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92a对结直肠癌和结直肠息肉具有良好的诊断能力。然而，生 理条件下循环的游离miRNA稳定性较差，限制了其作为可靠的生物标志物的应用。随着研究 的深入，研究人员发现细胞外囊泡中的miRNA不仅与分泌前母体一致性强而且得益于囊泡(外 泌体)脂质双层膜结构，其内容物具有了极强的稳定性，大大提升了miRNA在各应用领域的 应用。
[0006]面对愈加严峻的结直肠癌发生发展形势，如何有效地降低我国结直肠癌疾病负担已经成为 亟待解决的重大公共卫生问题。

技术实现思路

[0007]在一方面，本文提供了用于在受试者中进行结直肠癌状态诊断的检测试剂盒，其包括用于 检测来自所述受试者的生物样品中miRNA生物标志物水平的检测试剂，所述miRNA生物标 志物选自hsa
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3p、hsa
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5p和hsa
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3p及其任意组合。
[0008]在一些实施方案中，所述miRNA生物标志物包括hsa
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3p、hsa
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3p或 hsa
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5p；包括hsa
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3p、hsa
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5p和hsa
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于在受试者中进行结直肠癌状态诊断的检测试剂盒，包括用于检测来自所述受试者的生物样品中miRNA生物标志物水平的检测试剂，所述miRNA生物标志物选自hsa
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3p、hsa
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3p、hsa
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5p和hsa
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3p及其任意组合。2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其中所述miRNA生物标志物包括hsa
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3p或hsa
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5p；包括hsa
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5p；或者包括hsa
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5p和hsa
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3p。3.如权利要求1或2所述的检测试剂盒，其中所述miRNA生物标志物为hsa
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5p和hsa
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3p。4.如权利要求1
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3任一项所述的检测试剂盒，其中所述结直肠癌状态包括结直肠癌易感性或者结直肠癌的存在、进展、亚型、分期和/或分化状态。5.如权利要求1
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4任一项所述的检测试剂盒，其中所述结直肠癌状态为结直肠癌I期或II期，所述miRNA生物标志物为hsa
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3p和/或hsa
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5p；所述结直肠癌状态为腺癌，所述miRNA生物标志物为hsa
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3p、hsa
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5p和/或hsa
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3p；所述结直肠癌状态为粘液腺癌，所述miRNA生物标志物为hsa
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5p、hsa
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5p和/或hsa
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3p；所述结直肠癌状态为印戒细胞癌，所述miRNA生物标志物为hsa
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3p、hsa
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5p和/或hsa
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3p；或者所述结直肠癌状态为其他类型结直肠癌，所述miRNA生物标志物为hsa
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3p、hsa
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3p、hsa
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3p、hsa
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5p、hsa
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5p、hsa
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5p、hsa
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5p和/或hsa
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3p。6.如权利要求1
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5任一项所述的检测试剂盒，其中所述检测miRNA生物标志物水平的检测试剂包括逆转录引物、PCR扩增引物对和/或Taqman探针。7.如权利要求1
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6任一项所述的检测试剂盒，其中：用于检测hsa
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320a
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3p的水平的检测试剂包括：包括SEQ ID NO：10所示序列的逆转录引物；包括SEQ ID NO：19和28所示序列的PCR扩增引物对；和/或包括SEQ ID NO：29所示序列的Taqman探针；用于检测hsa
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miR
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19a
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3p的水平的检测试剂包括：包括SEQ ID NO：11所示序列的逆转录引物；包括SEQ ID NO：20和28所示序列的PCR扩增引物对；和/或包括SEQ ID NO：30所示序列的Taqman探针；用于检测hsa
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miR
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19b
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3p的水平的检测试剂包括：包括SEQ ID NO：12所示序列的逆转录引物；包括SEQ ID NO：21和28所示序列的PCR扩增引物对；和/或包括SEQ ID NO：31所示序列的Taqman探针；用于检测hsa
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miR
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31
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5p的水平的检测试剂包括：包括SEQ ID NO：13所示序列的逆转录引物；包括SEQ ID NO：22和28所示序列的PCR扩增引物对；和/或包括SEQ ID NO：32所示序列的Taqman探针；用于检测hsa
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miR
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92a
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3p的水平的检测试剂包括：包括SEQ ID NO：14所示序列的逆转录引物；包括SEQ ID NO：23和28所示序列的PCR扩增引物对；和/或包括SEQ ID NO：33所示
序列的Taqman探针；用于检测hsa
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miR
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196a
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5p的水平的检测试剂包括：包括SEQ ID NO：15所示序列的逆转录引物；包括SEQ ID NO：24和28所示序列的PCR扩增引物对；和/或包括SEQ ID NO：34所示序列的Taqman探针；用于检测hsa
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miR
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409
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5p的水平的检测试剂包括：包括SEQ ID NO：16所示序列的逆转录引物；包括SEQ ID NO：25和28所示序列的PCR扩增引物对；和/或包括SEQ ID NO：35所示序列的Taqman探针；用于检测hsa
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miR
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520d
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5p的水平的检测试剂包括：包括SEQ ID NO：17所示序列的逆转录引物；包括SEQ ID NO：26和28所示序列的PCR扩增引物对；和/或包括SEQ ID NO：36所示序列的Taqman探针；以及用于检测hsa
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miR
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33b
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3p的水平的检测试剂包括：包括SEQ ID NO：18所示序列的逆转录引物；包括SEQ ID NO：27和28所示序列的PCR扩增引物对；和/或包括SEQ ID NO：37所示序列的Taqman探针。8.如权利要求1
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7任一项所述的检测试剂盒，还包括用于检测作为内参基因的hsa
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let
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7d的水平的检测试剂；所述检测试剂包括：包括SEQ ID NO：38所示序列的逆转录引物；包括SEQ ID NO：39和28所示序列的PCR扩增引物对；和/或包括SEQ ID NO：40所示序列的Taqman探针。9.如权利要求1
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8任一项所述的检测试剂盒，还包括用于从所述生物样品中分离外泌体的试剂；任选地，还包括用于从所述外泌体提取miRNA的试剂。10.如权利要求1
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9任一项所述的检测试剂盒，还包括记载有根据所述miRNA生物标志物水平基于逻辑回归来判断所述受试者中结直肠癌状态的说明书。11.如权利要求1
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10任一项所述的检测试剂盒，其中所述生物样品选自血液、血清、血浆、粪便、乳液、腹水、尿和组织活检；优选血浆、血清或粪便。12.在受试者中鉴定结直肠癌状态的方法，包括：1)从来自所述受试者的生物样品中分离...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡鹏程，李明明，蒲珏，
申请(专利权)人：北京艾克伦医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：