食管癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用制造技术

本发明专利技术提供了食管癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用，方法以癌症诊断、早期筛查以及预后的重要生物指标DNA甲基化异常作为检测对象，通过检测食管脱落细胞或外周血的基因甲基化状态，实现无创检测，同时通过数字PCR技术，在微反应单元内高效灵敏地完成目标核酸片段的PCR扩增，获取荧光信号进行统计学分析，摆脱对标准曲线的依赖，直接给出靶序列的拷贝数，提高实验结果在批内和批间的稳定性，实现对起始样品的绝对定量，提高检测灵敏度，有效减少假阴性的出现，从而实现食管癌的早期筛查。的早期筛查。的早期筛查。

【技术实现步骤摘要】
食管癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体地涉及一种食管癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用。

技术介绍

[0002]食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，影响着全球超过45万人，其发病率也逐年增加，我国是食管癌的高发地区，每年平均病死约15万人。研究发现，食管癌早期患者的五年生存率可达到95％以上，但多数食管癌患者的早期症状不典型，若出现进行性吞咽困难一般已属中晚期，临床上食管癌的最佳治疗方案是手术切除，但患者预后差，五年生存率较低，总生存率不超过15％，因此建立食管癌预警和早期筛查的方法，对食管癌的防治非常重要，早发现、早诊断、早治疗、早手术是防控食管癌的有效手段。
[0003]目前用于食道癌的检测和筛查方法有影像学检测技术、组织活检、肿瘤血清标识物检测等。这此方法要么设备成本高，操作技术要求强，检测成本高；要么侵入性强，不适于早癌的筛查；要么灵敏度很低，无法满足临床检测需要。因此有必要开发灵敏、特异的新型食道癌标识物和检测技术，提高食道癌早癌检出率、改善食道癌治疗效果、降低食道癌死亡率。
[0004]表观遗传学是近年来肿瘤研究的热点领域，DNA的甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA调控等表观遗传学改变都被认为与肿瘤的发生有着密切关系，其中DNA的甲基化是最为常见的表观遗传学改变，其可调控细胞增殖、凋亡与分化，且水平与肿瘤的生物学特性密切相关。多种研究证明食管癌病变过程是一个多基因变异累积的复杂过程，涉及多种癌基因和抑癌基因的异常甲基化，其中大多数异常甲基化为抑癌基因的高甲基化，高甲基化往往导致抑癌基因的转录沉默。DNA甲基化异常通常发生在癌症早期，并贯穿癌症的发生和发展过程，其甲基化状态一旦形成需要受到外界环境较长时间的持续刺激才会发生改变，因此DNA甲基化指标的检测可以作为癌症诊断、早期筛查以及预后的重要生物指标。
[0005]数字PCR技术是继PCR和荧光定量PCR之后的第三代PCR技术，是灵敏度与特异性极高的核酸检测与定量手段，其基本原理是遵循泊松分布规律，通过将核酸样本稀释，将其均匀分配至数万个独立的微反应单元中，在微反应单元内高效灵敏地完成目标核酸片段的PCR扩增，获取荧光信号进行统计学分析，彻底摆脱对标准曲线的依赖而直接给出靶序列的拷贝数，提高了实验结果在批内和批间的稳定性，实现对起始样品的绝对定量，同时提高核酸检测方法的灵敏度，有效减少假阴性的出现。
[0006]有鉴于此，本专利技术通过筛选食管癌相关甲基化基因，建立基于数字PCR的食管癌基因甲基化检测方法，期望获取具有更高灵敏度、特异性和准确性的检测试剂，实现食管癌的早期筛查与诊断。

技术实现思路

[0007]为达到上述目的，本专利技术提供食管癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用，本专利技术通过TCGA数据库筛选出HOXD10、ZNF331、ECRG4等3个基因甲基化检测位点，并通过建立基于数字PCR的食管癌基因甲基化检测，得到灵敏度更高的食管癌检测试剂盒，实现食管癌的早期筛查与诊断，利于食管癌的早诊早治。
[0008]本专利技术第一方面提供食道癌基因甲基化检测位点，所述的基因甲基化检测位点包括HOXD10、ZNF331、ECRG4中的一种或多种。
[0009]本专利技术第二方面提供食道癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，包括以下1)
‑
3)所示的核酸序列组合中的一种或多种：
[0010]1)HOXD10甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合2或引物探针组合3，其中所述引物探针组合2包括如SEQ ID NO.4所示的上游引物、如SEQ ID NO.5所示的下游引物、如SEQ ID NO.6所示的荧光探针，所述引物探针组合3包括如SEQ ID NO.7所示的上游引物、如SEQ ID NO.8所示的下游引物、如SEQ ID NO.9所示的荧光探针；
[0011]2)ZNF331甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合4或引物探针组合5，其中所述引物探针组合4包括如SEQ ID NO.10所示的上游引物、如SEQ ID NO.11所示的下游引物、如SEQ ID NO.12所示的荧光探针，所述引物探针组合5包括如SEQ ID NO.13所示的上游引物、如SEQ ID NO.14所示的下游引物、如SEQ ID NO.15所示的荧光探针；
[0012]3)ECRG4甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合7或引物探针组合8，其中所述引物探针组合7包括如SEQ ID NO.19所示的上游引物、如SEQ ID NO.20所示的下游引物、如SEQ ID NO.21所示的荧光探针，所述引物探针组合8包括如SEQ ID NO.22所示的上游引物、如SEQ ID NO.23所示的下游引物、如SEQ ID NO.24所示的荧光探针。
[0013]在本专利技术一实施例中，所述的食管癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，还包括检测内参基因GAPDH的PCR引物及探针，所述引物包括如SEQ ID NO.28所示的上游引物、如SEQ ID NO.29所示的下游引物，所述探针包括如SEQ ID NO.30所示的荧光探针。
[0014]在本专利技术一实施例中，所述荧光探针的5
’
端包含有荧光报告基团，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5中的任意一种。
[0015]在本专利技术一实施例中，所述荧光探针的3
’
端包含有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ
‑
1、BHQ
‑
2、BHQ
‑
3中的任意一种。
[0016]在本专利技术一优选实施例中，所述荧光淬灭基团为MGB。
[0017]本专利技术第三方面提供食管癌基因甲基化检测试剂盒，所述试剂盒包括如本专利技术第二方面所述的PCR引物探针组合，还包括阳性质控品以及阴性质控品。
[0018]在本专利技术一实施例中，所述阳性质控品为人食管癌细胞系DNA。
[0019]在本专利技术一实施例中，所述阴性质控品为人外周血白细胞DNA。
[0020]在本专利技术一实施例中，所述食管癌基因甲基化检测试剂盒反应体系的终浓度组成包括：0.1
‑
1μM PCR引物、0.1
‑
1μM探针。
[0021]在本专利技术一优选实施例中，所述食管癌基因甲基化检测试剂盒反应体系的终浓度组成包括：0.1
‑
0.5μM PCR引物、0.1
‑
0.5μM探针。
[0022]在本专利技术一实施例中，所述食管癌基因甲基化检测试剂盒的数字PCR反应条件如下：
[0023]在本专利技术一优选实施例中，所述食管癌基因甲基化检测试剂盒的数字PCR反应条件如下：
[0024]本专利技术第四方面提供食管癌基因甲基化检测方法，包括以下步骤：
[0025]1)分离待测生物样品中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.食道癌基因甲基化检测位点，其特征在于，所述的基因甲基化检测位点包括HOXD10、ZNF331、ECRG4中的一种或多种。2.食道癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，其特征在于，包括以下1)
‑
3)所示的核酸序列组合中的一种或多种：1)HOXD10甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合2或引物探针组合3，其中所述引物探针组合2包括如SEQ ID NO.4所示的上游引物、如SEQ ID NO.5所示的下游引物、如SEQ ID NO.6所示的荧光探针，所述引物探针组合3包括如SEQ ID NO.7所示的上游引物、如SEQ ID NO.8所示的下游引物、如SEQ ID NO.9所示的荧光探针；2)ZNF331甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合4或引物探针组合5，其中所述引物探针组合4包括如SEQ ID NO.10所示的上游引物、如SEQ ID NO.11所示的下游引物、如SEQ ID NO.12所示的荧光探针，所述引物探针组合5包括如SEQ ID NO.13所示的上游引物、如SEQ ID NO.14所示的下游引物、如SEQ ID NO.15所示的荧光探针；3)ECRG4甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合7或引物探针组合8，其中所述引物探针组合7包括如SEQ ID NO.19所示的上游引物、如SEQ ID NO.20所示的下游引物、如SEQ ID NO.21所示的荧光探针，所述引物探针组合8包括如SEQ ID NO.22所示的上游引物、如SEQ ID NO.23所示的下游引物、如SEQ ID NO.24所示的荧光探针。3.如权利要求2所述的食道癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，其特征在于，还包括检测内参基因GAPDH的PCR引物及探针，其中，所述引物包括如SEQ ID NO.28所示的上游引物、如SEQ ID NO.29所示的下游引物，所述探针包括如...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵琦，
申请(专利权)人：安徽达健医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：