一种模板多核苷酸配对末端测序方法、试剂盒技术

本发明专利技术涉及基因测序技术领域，具体涉及一种模板多核苷酸配对末端测序方法、试剂盒。本发明专利技术对用于产生互补链的延伸引物进行特殊设计，形成至少由第一延伸引物、第二延伸引物连接为一体的延伸引物结构，并设计第一延伸引物在模板多核苷酸上的结合位点位于第二延伸引物结合位点的上游。在具有链置换活性的环境下，上游延伸引物的延伸链置换下游延伸引物的延伸链，被置换的下游延伸引物的延伸链通过第二延伸引物连接在第一延伸引物上，再通过第一延伸引物的延伸链结合在模板多核苷酸链上，再通过模板多核苷酸链固定在固体支持物上，提高互补链在循环测序环境中的稳定性，提高测序质量。量。量。

【技术实现步骤摘要】
一种模板多核苷酸配对末端测序方法、试剂盒


[0001]本专利技术涉及基因测序
，具体涉及一种模板多核苷酸配对末端测序方法、试剂盒。

技术介绍

[0002]配对末端或成对测序技术在分析生物学领域是公知的，配对末端测序允许确定来自一条多核苷酸双链两个位置的序列的两个读取。由于配对末端序列并非是完全随机的，而是已知发生在单个双链上，在基因组中是相连或成对的，有助于将全基因组的序列组合成一致的序列，提高一次测序获得的序列信息的长度。
[0003]现有技术中公开的基于阵列多核苷酸模板的配对末端测序方法包括，WO2004/070005中公开的在固体支持物上实施的，将两个或多个引物同时与靶多核苷酸杂交，在杂交步骤之后，除一个引物之外，封闭其他所有与模板杂交的引物，未被封闭的引物进行延伸测序，完成测序之后，被封闭引物中的一个解除封闭以得到游离3
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羟基进行另一个延伸测序反应。该方法实施过程中虽然阵列的多核苷酸模板始终连接在固体支持物上，保持多核苷酸模板链的稳定性，但是必须要确保只有一个引物可延伸，其他引物必须完全封闭，在实际操作过程中很难确保其他引物的完全封闭，导致高的测序错误率；WO2007010252公开了在固体支持物上形成双链模板簇，将双链模板簇变性形成单链簇，去除部分双链模板簇的其中一条链，对剩余的一条链进行测序；完成一次测序后，对 剩余部分双模板簇中的与一次测序中序列相同的单链模板去除，对剩余的与该去除的模板链互补的链进行测序，完成双链模板的双末端测序。该方法一次只能对一部分簇的一条链进行测序，不能完全利用所有的簇，导致测序信号强度达不到预期；WO2008041002公开了首先对全部的双链模板簇的其中一条链去除，对剩余的链测序，然后再以剩余的链为模板扩增形成其互补链，对其互补链进行测序，最终实现双末端测序；并具体公开了互补链的形成依赖固体支持物模板上设置的与第一次测序链的3端互补杂交的接头引物，并且该方法也依赖于首先形成双链模板簇，限制了该方法的应用范围。由此需要改进互补链的生成方式，使方法的实施应用不依赖于双链模板簇，也不依赖于固体支持物上特别设置的特殊接头，扩大双末端测序方法的应用范围。
[0004]例如，WO2016/133764公开了基于链置换原理生成互补链实现双末端测序的方法，通过第一引物与模板链杂交延伸形成于模板链互补的第二链，第二引物与模板链杂交延伸形成第三链的同时置换出第二链，控制第二链的置换，确保第二链在3端与模板链的部分互补杂交，形成部分与模板链杂交，部分悬伸的第二链，对第二链悬伸部分进行测序。该方法实施过程中，对形成的互补链（第二链）的固定是通过第二链靠近3端的部分与模板链部分互补杂交，该固定方式稳定性相对比较差，在延伸测序的反复循环冲洗的过程中容易脱落，降低测序信号，影响测序质量。鉴于此，需要进一步改进生成的互补链的固定方式，提高互补链在循环测序反应中的稳定性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一是提供一种多核苷酸模板配对末端测序方法，提高第二末端测序实施过程中形成的互补链的稳定性，提高测序质量。
[0006]同时，本专利技术还在于提供一种实施本专利技术测序方法的试剂盒。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种模板多核苷酸配对末端测序方法，包括以下操作步骤：S1、提供固定在固体支持物上的阵列的单链模板多核苷酸簇，加入第一测序引物，对单链模板多核苷酸至少部分序列进行测序，获得第一测序引物的延伸多核苷酸链和对应的第一末端序列信息；S2、去除第一测序引物的延伸多核苷酸链，加入延伸引物；其中延伸引物包括连接为一体的第一延伸引物和第二延伸引物，模板多核苷酸上具有第一延伸引物的结合位点和第二延伸引物的结合位点；其中第一延伸引物的结合位点位于第二延伸引物结合位点的上游；S3、将延伸引物与模板多核苷酸退火杂交，在具有链置换反应活性的环境下，第一延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第一延伸链至少部分置换第二延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第二延伸链，第二延伸链存在至少部分不与模板多核苷酸杂交结合，称为第二延伸链的悬伸部分；S4、加入第二测序引物对第二延伸链的悬伸部分进行测序，获得对应的第二末端序列信息，完成模板多核苷酸的配对末端测序。
[0008]实现配对末端测序的整体方案大体上都是首先对单链模板多核苷酸至少部分完成测序，获得第一端的序列信息；然后生成单链模板多核苷酸的互补链进行测序获得第二端的序列信息。然而，在该整体方案实施过程中最主要的问题是生成的互补链如何能够稳定存在循环测序、冲洗的环境中，即最主要的问题是如何将生成的互补链稳定固定在固相支持物上。为了解决上述问题，本专利技术对用于与模板多核苷酸互补杂交延伸产生互补链的延伸引物进行特殊设计，形成至少由第一延伸引物、第二延伸引物连接为一体的延伸引物结构，并设计第一延伸引物在模板多核苷酸上的结合位点位于第二延伸引物结合位点的上游。该延伸引物加入阵列的单链模板多核苷酸的固体支持物上，一种情况是延伸引物与一条模板多核苷酸链杂交结合；另一种情况是一条模板多核苷酸链上杂交结合两个延伸引物，每个延伸引物对应与两条模板多核苷酸链杂交结合。
[0009]无论是哪种情况，在具有链置换活性的环境下，第一延伸引物的延伸链合成过程中会置换第二延伸引物的延伸链，第二延伸引物形成的与模板多核苷酸互补的延伸链不与模板多核苷酸链结合，悬伸在测序环境中，作为第二端测序的模板链；并且由于第一延伸引物与第二延伸引物连接为一体，第二延伸引物产生的延伸链通过第二延伸引物连接在第一延伸引物上，再通过第一延伸引物的延伸链结合在模板多核苷酸链上，再通过模板多核苷酸链固定在固体支持物上，即通过设计连接为一体结构的第一延伸引物和第二延伸引物，利用链置换扩增的原理产生模板多核苷酸的互补链，并将互补链间接固定在固体支持物上，提高互补链在循环测序环境中的稳定性，提高测序质量，更好地解决现有技术存在的技术问题。
[0010]为了更进一步提高互补链的稳定性，可选的，延伸引物还包括与第一延伸引物和
第二延伸引物连接为一体的第三延伸引物，第三延伸引物在模板多核苷酸上的结合位点与第一延伸引物相同；步骤S3中延伸引物至少与两条并列的单链模板多核苷酸杂交结合，第三延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第三延伸链至少部分置换第二延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第二延伸链。
[0011]更进一步的，所述延伸引物还包括与第一延伸引物、第二延伸引物、第三延伸引物连接为一体的第四延伸引物，第三延伸引物在模板多核苷酸上的结合位点与第二延伸引物相同；步骤S3中延伸引物至少与两条并列的单链模板多核苷酸杂交结合，第三延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第三延伸链至少部分置换第四延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第四延伸链。
[0012]无论延伸引物的连接组成结构是两条、三条或是四条，其与模板多苷酸链的杂交结合反应原理是相同的，只需要确保模板多核苷酸上具有间隔设置的下游结合位点和上游结合位点，不同的延伸引物连接为一体，在具有链置换反应活性的环境下发生链置换扩本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种模板多核苷酸配对末端测序方法，其特征在于，包括以下操作步骤：S1、提供固定在固体支持物上的阵列的单链模板多核苷酸簇，加入第一测序引物，对单链模板多核苷酸至少部分序列进行测序，获得第一测序引物的延伸多核苷酸链和对应的第一末端序列信息；S2、去除第一测序引物的延伸多核苷酸链，加入延伸引物；其中延伸引物包括连接为一体的第一延伸引物和第二延伸引物，模板多核苷酸上具有第一延伸引物的结合位点和第二延伸引物的结合位点；其中第一延伸引物的结合位点位于第二延伸引物结合位点的上游；S3、将延伸引物与模板多核苷酸退火杂交，在具有链置换反应活性的环境下，第一延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第一延伸链，第一延伸链至少部分置换第二延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第二延伸链，第二延伸链存在至少部分不与模板多核苷酸杂交结合，称为第二延伸链的悬伸部分；S4、加入第二测序引物对第二延伸链的悬伸部分进行测序，获得对应的第二末端序列信息，完成模板多核苷酸的配对末端测序。2.如权利要求1所述的模板多核苷酸配对末端测序方法，其特征在于，所述延伸引物还包括与第一延伸引物和第二延伸引物连接为一体的第三延伸引物，第三延伸引物在模板多核苷酸上的结合位点与第一延伸引物相同；步骤S3中延伸引物至少与两条并列的单链模板多核苷酸杂交结合，第三延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第三延伸链至少部分置换第二延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第二延伸链。3.如权利要求2所述的模板多核苷酸配对末端测序方法，其特征在于，所述延伸引物还包括与第一延伸引物、第二延伸引物、第三延伸引物连接为一体的第四延伸引物，第四延伸引物在模板多核苷酸上的结合位点与第二延伸引物相同；步骤S3中延伸引物至少与两条并列的单链模板多核苷酸杂交结合，第三延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第三延伸链至少部分置换第四延伸引物产生的与模板多核苷酸互补的第四延伸链。4.如权利要求1~3任一项所述的模板多核苷酸配对末端的测序方法，其特征在于，结合位点在上游的延伸引物的Tm值低于结合位点在下游的延伸引物的Tm值，结合位点在上游的延伸引物与结合位点在下游的延伸引物的Tm值差值为5~10℃。5.如权利要求1~3任一项所述的模板多核苷酸配对末端的测序方法，其特征在于，步骤S3中上游结合位点的延伸引物产生的延伸链完全置换下游结合位点的延伸引物产生的延伸链，被置换出的延伸链不与模板多核苷酸杂交结合，完全悬伸。6.如权利要求1~3任一项所述的模板多核苷酸配对末端的测序方法，其特征在于，所述单链模板多核苷酸包括第一衔接子、第二衔接子以及插入在第一衔接子和第二衔接子之间的靶DNA序列。7.如权利要求6所述的模板多核苷酸配对末端的测序方法，其特征在于，第一衔接子包括第一测序引物结合位点、延伸引物结合位点；第二测序引物与第二衔接子的至少部分序列相同。8.如权利要求7所述的模板多核苷酸配对末端的测序方法，其特征在于，所述第二衔接子还包括将模板多核苷酸固定在固体支持物上的元件。9.如权利要求7所述的模板多核苷酸配对末端的测序方法，其特征在于，所述第一衔接子和第二衔接子还包括标签序列。

【专利技术属性】
技术研发人员：王亚文，王玲玲，
申请(专利权)人：郑州思昆生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：