一种对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法技术

一种对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法,其特征在于，包括如下步骤：步骤1，采集外周血并分离出单个核细胞，对分离出的单个核细胞进行培养，留取悬浮细胞和贴壁细胞；步骤2，通过所述贴壁细胞培养出成熟DC细胞；步骤3，通过所述悬浮细胞利用特定免疫细胞基础培养液进行接种以培养出特定免疫细胞培养体系；步骤4，向所述特定免疫细胞培养体系中加入在所述步骤2中获得的DC细胞进行共培养。加入在所述步骤2中获得的DC细胞进行共培养。加入在所述步骤2中获得的DC细胞进行共培养。

【技术实现步骤摘要】
一种对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法


[0001]本专利技术涉及获取用于过继免疫疗法的免疫细胞，特别是一种对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法。

技术介绍

[0002]由于肿瘤具有较高的损害性和较高的病死率，对抗肿瘤的治疗手段的研究和应用一直是人们关注的焦点，肿瘤免疫治疗是在临床用于肿瘤治疗的第四大疗法，其中免疫细胞疗法在中国得到广泛的应用，目前国内开展最多的就是免疫细胞过继性回输疗法。
[0003]DC细胞：又称树突状细胞(Dendritic cells ,DC)，是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells ,APC)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原。未成熟 DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。DC与肿瘤的发生、发展有着密切关系，大部分实体瘤内浸润的DC数量多则患者预后好。
[0004]γδT细胞具有在体内快速反应的特性，在受到刺激时，会先于αβ
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T细胞释放促炎性细胞因子（IFN
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γ和TNF
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α等）。γδT细胞能够激活NK细胞的肿瘤毒作用，与DC细胞互刺激成熟，APC细胞抗原呈递的功能，激活αβ
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T细胞的免疫效应，γδT细胞的杀伤作用具有非MHC限制性，广泛的杀瘤谱，已知对至少十几种肿瘤细胞具有杀伤作用。
[0005] NK细胞是人体天然免疫系统的细胞，是负责杀伤老化、受病毒感染、肿瘤等异常细胞的最主要“战士”。NK细胞与人体其他的白细胞不同，它不需要接受免疫系统的特殊指令，也不需要其他细胞的配合，自己单独就能识别和攻击外来细胞、癌细胞和病毒感染的细胞。所以，NK细胞被称为是人体的第一道防线，可非特异性直接杀伤异常细胞，这种天然杀伤活性既不需要抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制性。除了具有强大的杀伤功能外，还具有很强的免疫调节功能，与机体其他多种免疫细胞互相作用，调节机体的免疫状态和免疫功能。
[0006]CIK细胞(cytokine
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induced killer)：是多种细胞因子诱导的杀伤细胞，是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。CIK细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。
[0007]肿瘤的传统治疗方法常用的有手术、放疗和化疗三种，但这三种方法均不能彻底清除体内的瘤细胞，而免疫治疗借助于调节肿瘤细胞和宿主免疫反应，来刺激免疫系统识别和杀伤肿瘤细胞。其中，体内回输免疫活性细胞的过继免疫疗法具有一定的抗肿瘤效果。与其它的抗肿瘤药物相比，对机体免疫系统的结构和功能不产生损伤，可以直接杀伤肿瘤细胞，并且调节和增强机体的免疫功能，因而成为治疗肿瘤的重要辅助手段，为预防肿瘤复发，改善晚期患者的生存质量提供了新途径。过继性免疫治疗是指将有免疫活性的自体或者同种异体的免疫细胞输给患者，为患者提供现成的免疫力，以达到治疗目的的治疗方法。为了达到更好的抗肿瘤效果，用于过继免疫疗法的免疫活性细胞必须具有较强的细胞毒活
性和增殖能力。
[0008]现有体外培养的抗瘤免疫细胞存在以下缺点：1.在现有的研究中，大多采用单一的免疫细胞或杀伤性细胞进行细胞治疗，这种疗法的缺陷在于一种免疫细胞对于肿瘤的异质性群体是不能完全有效的，因其在识别肿瘤靶点上较为单一，只能识别几种表达固定肿瘤信号模式的靶标进行识别，杀伤肿瘤效果差。在体内针对肿瘤的作用效果随着时间的递进而减弱，直至被体内的肿瘤微环境所抑制；2.传统单一免疫细胞在体内无法做到有效协同，互相促进免疫系统激活，激活细胞受体，抑制癌细胞抑制配体，导致单一免疫细胞进入体内易被肿瘤微环境所抑制，容易出现衰老和凋亡。甚至进入机体后被肿瘤以及在微环境中被肿瘤细胞捕获，转变成有利于肿瘤的进展甚至扩散的细胞；3.传统单一免疫细胞缺乏特异性，没有经过抗原提呈细胞所负载的抗原多肽等训练，且传统的肽段没有对DC呈现出有效的激活。导致识别肿瘤的精准性特异性低，杀伤效果差；4.传统广谱性免疫细胞对实体瘤的浸润性差，只能在肿瘤外围徘徊，而不能深入肿瘤内部；5.现有细胞技术扩增效率低，往往采取经过基因编辑以及灭活过的K562癌细胞进行刺激增殖，在伦理上来说，不人道，有一定的安全风险。
[0009]因此，建立一种可以对肿瘤异质性病变细胞群有效杀伤的复合免疫细胞体系是至关重要的，为解决传统免疫细胞疗法非精准特异性、识别靶标单一、易衰老，体内留存短、浸润差、扩增低等问题，利用癌细胞多肽片段训练抗原提呈细胞激活包含NK、NKT以及γδT、CTL、Inkt，CD4调节型细胞，提高肿瘤识别特异性，除此之外利用如CD28、Gardiquimod、CD161、poly等大幅提升活化免疫细胞的杀瘤所需的伽马干扰素、肿瘤坏死因子的含量，并通过不同免疫细胞的配比验证使免疫细胞达到互相协同，达到抵制肿瘤耐受的配比。进而达到对肿瘤的高杀伤效果。

技术实现思路

[0010]为了解决上述技术问题，本专利技术提出如下解决方案：一种对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法，包括如下步骤：步骤1，采集外周血并分离出单个核细胞，对分离出的单个核细胞进行培养，留取悬浮细胞和贴壁细胞；步骤2，通过所述贴壁细胞培养出成熟DC细胞；步骤3，通过所述悬浮细胞利用特定免疫细胞基础培养液进行接种以培养出特定免疫细胞培养体系；步骤4，向所述特定免疫细胞培养体系中加入在所述步骤2中获得的DC细胞进行共培养。
[0011]根据本专利技术的一个优选实施例，所述特定免疫细胞选自γδT细胞和NKT/NK细胞中的至少一个。
[0012]根据本专利技术的一个优选实施例，所述步骤3中还包括如下步骤：步骤301，根据特定的免疫细胞加入相应的成分并置于适宜环境下进行培养；
步骤302，在培养了第一预定时间后进行第一补液操作，然后再培养第二预定时间。
[0013]根据本专利技术的一个优选实施例，当所述特定免疫细胞选择为γδT细胞时，所述相应的成分包括唑来膦酸、CD28、Gardiquimod和白介2，所述第一补液包括白介素因子IL2和自体血清；当所述特定免疫细胞选择为NKT/NK细胞时，所述相应的成分包括重组黏连蛋白、CD3、CD161和透明质酸，所述第一补液包括白介素因子IL2和白介素IL7、IL15、IL18、IL21。
[0014]根据本专利技术的一个优选实施例，在步骤4中还包括如下步骤：步骤401，在共培养期间，每间隔第三预定时间进行第二补液。
[0015]根据本专利技术的一个优选实施例，所述第一预定时间为72
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96小时，所述第二预定时间为5天，第三预定时间为1天。
[0016]根据本专利技术的一个优选实施例，当所述特定免疫细胞选择为γδT细胞时所述第二补液包括：白介素因子IL2；当所述特定免疫细胞选择本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，采集外周血并分离出单个核细胞，对分离出的单个核细胞进行培养，留取悬浮细胞和贴壁细胞；步骤2，通过所述贴壁细胞培养出成熟DC细胞；步骤3，通过所述悬浮细胞利用特定免疫细胞基础培养液进行接种以培养出特定免疫细胞培养体系；步骤4，向所述特定免疫细胞培养体系中加入在所述步骤2中获得的DC细胞进行共培养。2.根据权利要求1所述的对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法，其特征在于，所述特定免疫细胞选自γδT细胞和NKT/NK细胞中的至少一个。3.根据权利要求2所述的对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法，其特征在于，所述步骤3中还包括如下步骤：步骤301，根据特定的免疫细胞加入相应的成分并置于适宜环境下进行培养；步骤302，在培养了第一预定时间后进行第一补液操作，然后再培养第二预定时间。4.根据权利要求3所述的对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法，其特征在于，当所述特定免疫细胞选择为γδT细胞时，所述相应的成分包括唑来膦酸、CD28、Gardiquimod和白介2，所述第一补液包括白介素因子IL2和自体血清；当所述特定免疫细胞选择为NKT/NK细胞时，所述相应的成分包括重组黏连蛋白、CD3、CD161和透明质酸，所述第一补液包括白介素因子IL2和白介素IL7、IL15、IL18、IL21。5.根据权利要求4所述的对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法，其特征在于，在步骤4中还包括如下步骤：步骤401，在共培养期间，每间隔第三预定时间进行第二补液。6.根据权利要求5所述的对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：李久续，山口桥一郎，
申请(专利权)人：全球细胞控股广州有限公司，
类型：发明
国别省市：