一种楠木种胚无菌苗的培养方法技术

本发明专利技术提供一种楠木种胚无菌苗的培养方法，包括如下步骤：1)对楠木种子进行预处理，选取种子并置于培养皿中，将种皮划开，冲洗，得到种胚；2)将得到的种胚，用无菌水冲洗，用乙醇溶液浸泡1.8

【技术实现步骤摘要】
一种楠木种胚无菌苗的培养方法


[0001]本专利技术属于植物组织培养
，尤其涉及一种楠木种胚无菌苗的培养方法。

技术介绍

[0002]楠木(Phoebezhennan S.W.Lee etF.N.Wei)为樟科(Lauraceae)楠属(Phoebe)亚热带常绿大乔木，楠木又称桢楠，是我国特有的园林绿化树种和珍贵用材树种。根据《博古要览》，楠木可分为三种：香楠、金丝楠木和水楠。在我国，楠木主要分布在贵州西北部、湖北西部、四川及重庆。由于人类长期以来的过度伐用、楠木生长发育缓慢及人工培育技术不完善等，造成了目前楠木资源破坏严重，开展楠木组培技术研究是楠木资源保护和良种选育的方法之一。
[0003]植物组织培养是利用其细胞具有全能性的特定再人工施以干预引导的环境，将择选消毒后的外植体置入特定培养基中诱导并形成完整植株的过程。外植体无菌体系的建立是楠木组培技术研究的前提条件。目前楠木组培研究的外植体多选择嫩叶或带腋芽的茎段，比如魏欢平等发表的题为“桢楠愈伤组织诱导初探”的论文，然而利用种子培养无菌苗作为外植体的研究则鲜有报道。利用种子培养无菌苗的优点是不受外界环境限制，任何时候都可以制备，且获得无菌苗的叶、茎、子叶节以及下胚轴等均可作为组培技术研究，同时也存在如下不足之处：消毒往往不彻底，容易污染，种子发芽慢，发芽时间较长，发芽率低。楠木种子的污染率相对较高，通常高达50％以上，其原因可能是由于种子的种皮自带内生菌。余云云的硕士学位论文“桢楠组培技术研究”公开了：桢楠带芽茎段的最佳消毒措施是以0.1％HgCl2溶液处理4.5min，污染率控制在40％左右，且萌发率最高，达到了68.42％。在此基础上增加处理时间，以0.1％HgCl2施以5.5
‑
15min时的污染率没有区别，但是芽萌发率却降到了15.39％。以0.1％升汞浸泡外植体3.0
‑
3.5min，或者用不同浓度的NaClO溶液浸泡15min时，污染率突增，污染率达到了90％左右。可见，通过延长消毒时间的方式来控制污染率，很可能导致芽萌发率的降低。
[0004]现有技术尚未发现使用楠木种子培养无菌苗的报道，使用楠木种子进行无菌苗培养的方法，在控制污染率的同时提高发芽率具有重要意义。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种楠木种胚无菌苗的培养方法，使用楠木种子进行培养，通过消毒剂的组合及时间控制，并使用添加特定浓度赤霉素GA3的MS培养基进行萌发培养，使存活率控制在75％以上，污染率控制在10％以下，萌发率达到90％以上。
[0006]本专利技术的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。
[0007]一种楠木种胚无菌苗的培养方法，包括如下步骤：
[0008]1)对楠木种子进行预处理，选取颗粒饱满、无病虫害的种子并置于培养皿中，将种皮划开，冲洗，得到种胚；优选地，用解剖刀将种皮划开，尽可能保持子叶的完整，注意不要
伤害种胚；
[0009]2)将步骤1)得到的种胚，在超净工作台或生物安全柜中用无菌水冲洗，用乙醇溶液浸泡1.8
‑
2.2min后，无菌水冲洗，然后加入升汞溶液消毒18
‑
20min后，用无菌水冲洗，得到消毒后的种胚；
[0010]3)将所述消毒后的种胚吸干表面水分，用解剖刀切掉78％
‑
82％的子叶，选取带有18％
‑
22％子叶的胚，接种至添加1.8
‑
2.2mg/L赤霉素GA3的MS培养基中进行萌发培养40
‑
60d，得到无菌苗。
[0011]优选地，所述步骤1)中的预处理包括如下步骤：将楠木种子用0.4％
‑
0.6％质量百分含量的高锰酸钾溶液浸泡40
‑
80min，洗净阴干，在含1.5％
‑
2.5％质量百分含量的洗洁精水溶液中浸泡8
‑
12min，将漂浮在水面的发育不完整及干瘪种子挑出。通过预处理，将不够理想的种子及时挑出，便于选取颗粒饱满、无病虫害的种子进行培养。
[0012]优选地，所述乙醇溶液的体积分数为75％，浸泡时间为2min。
[0013]优选地，所述升汞溶液的质量分数为0.1％，消毒时间为18min。乙醇溶液和升汞溶液的消毒时间相配合，在75％体积分数的乙醇溶液浸泡消毒2min后，使用0.1％质量分数的升汞溶液消毒时间18min，此时的存活率高达85％以上，污染率低于7％。升汞溶液的浓度应较低，否则容易对外植体造成伤害。
[0014]优选地，所述萌发培养的条件包括：培养温度为(25
±
2)℃、光照/黑暗周期为11
‑
13h/11
‑
13h、光照强度为2000
‑
2500lx。
[0015]优选地，所述赤霉素GA3的浓度为2mg/L。赤霉素GA3的浓度较低，发芽时间低至7
‑
20d，萌发率高达90％以上。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的有益效果包括：
[0017](1)本专利技术技术可以随时进行无菌苗制备，解决了现有技术采集嫩叶或腋芽为消毒外植体的方法存在的受季节限制的问题。
[0018](2)本专利技术发现楠木种子在消毒过程中，如果消毒剂浓度和消毒时间不够合理，则会造成种子污染率和死亡率严重，并进而导致发芽率受抑制等问题。本专利技术采用75％乙醇溶液结合0.1％升汞溶液浸泡消毒的方法，用解剖刀切除大部分子叶(以减少污染率)，并利用特定浓度赤霉素对楠木种子萌发的促进作用，提高了消毒的彻底性，降低了污染率和死亡率，增加了种子的萌发率，提高了楠木无菌苗的获得效率。
附图说明
[0019]图1楠木种胚萌发过程示意图；其中1
‑
A为种胚刚放入MS培养基时的示意图；1
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B为种胚萌发7天时的示意图；1
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C为种胚萌发40天时的示意图；1
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D为种胚萌发60天得到的无菌苗示意图。
[0020]图2不同GA3浓度对种胚培养20天的影响结果示意图；其中，2
‑
A为不含GA3的MS培养基萌发幼苗结果示意图；2
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B为添加1mg/L GA3的MS培养基萌发幼苗结果示意图；2
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C为添加2mg/L GA3的MS培养基萌发幼苗结果示意图；2
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D为添加3mg/L GA3的MS培养基萌发幼苗结果示意图。
具体实施方式
[0021]下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明。
[0022]本专利技术中，所涉及的材料和试剂均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。例如：MS培养基成分为：4.43g MS基础培养基+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH值为6.0，MS基础培养基购自美国Sigma公司。
[0023]实施例一楠木种胚无菌苗的培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种楠木种胚无菌苗的培养方法，其特征在于：包括如下步骤：1)对楠木种子进行预处理，选取颗粒饱满、无病虫害的种子并置于培养皿中，将种皮划开，冲洗，得到种胚；2)将步骤1)得到的种胚，在超净工作台或生物安全柜中用无菌水冲洗，用乙醇溶液浸泡1.8
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2.2min后，无菌水冲洗，然后加入升汞溶液消毒18
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20min后，用无菌水冲洗，得到消毒后的种胚；3)将所述消毒后的种胚吸干表面水分，用解剖刀切掉78％
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82％的子叶，选取带有18％
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22％子叶的胚，接种至添加1.8
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2.2mg/L赤霉素GA3的MS培养基中进行萌发培养40
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60d，得到无菌苗。2.根据权利要求1所述的楠木种胚无菌苗的培养方法，其特征在于：所述步骤1)中的预处理包括如下步骤：将楠木种子用0.4％
‑
0.6％质量百分含量的高锰酸钾溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵丹，谢娜，王建存，赵德刚，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：