一种同时分泌人IL-10和TGF-β的可示踪脐带间充质干细胞的制备及其应用制造技术

本发明专利技术涉及医学治疗技术领域，尤其涉及一种同时分泌人IL

【技术实现步骤摘要】
一种同时分泌人IL
‑
10和TGF
‑
β
的可示踪脐带间充质干细胞的制备及其应用


[0001]本专利技术涉及医学治疗
，特别是涉及一种同时分泌人IL
‑
10和TGF
‑
β的可示踪脐带间充质干细胞的制备及其应用。

技术介绍

[0002]骨关节炎是一种常见的慢性退行性关节疾病，临床表现为关节疼痛、变形，行走障碍。骨关节炎患者关节软骨损伤后，形成局灶性病变，关节周围组织如滑膜逐渐被侵蚀，导致长期的滑膜慢性炎症。滑膜炎症虽然不是骨关节炎发病的直接诱导因素，但滑膜炎能够加剧软骨破坏，加快骨关节炎的发展。骨关节炎的早期到晚期，均伴有滑膜炎的发生与发展，关节腔镜和组织学检查表明滑膜是骨关节炎中发生炎性反应的主要部位。A型巨噬细胞是滑膜组织的主要组成细胞成分，在滑膜炎症中起到关键的作用。巨噬细胞可分为M1和M2，M1可简述为促炎性细胞，而M2是抑制免疫应答的调节性细胞，在不同的细胞因子微环境中二者可以相互极化。体外培养的环境下M2型巨噬细胞可通过IFN
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g或LPS刺激极化为促炎性的巨噬细胞M1，在IL
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10、IL
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4、TGF
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β等细胞因子的诱导下M1巨噬细胞可极化为免疫抑制性的M2巨噬细胞。M2型巨噬细胞不仅可以抑制炎性细胞免疫反应，还可以促进组织修复。通过治疗手段将滑膜组织中的巨噬细胞向M2极化将是有效治疗骨关节炎的重要手段之一。
[0003]间充质干细胞可分泌多种免疫抑制性的细胞因子、生长因子和趋化因子等可以调节免疫、促进组织损伤修复等功效。人脐带中间充质干细胞含量、增殖能力优于骨髓间充质干细胞，免疫原性比骨髓间充质干细胞低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，使其成为理想的再生医学研究和应用的功能细胞。近年来，脐带间充质干细胞在骨关节炎的治疗方面进行了大量的尝试，包括全身性的回输和局部的注射等治疗方式，均取得了良好的治疗效果。虽然间充质干细胞通过分泌多种免疫调节因子来抑制关节炎症性微环境，但是往往关键的免疫调节细胞因子分泌水平较低，导致了骨关节炎症状缓解周期较长，治疗效果往往需要依赖于多次的治疗。因而治疗成本较高，患者也会感到不便。另外，局部注射间充质干细胞的药代动力学参数仍然不是非常明确，需要通过更直观的手段去记录和检测间充质干细胞在局部的存活周期、聚集密度、迁移特点等药代动力学参数，为干细胞临床应用提供更加科学和严谨的数据支撑。
[0004]本专利技术构建了一种能够同时分泌IL
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10和TGF
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β细胞因子的脐带间充质干细胞，同时该细胞表达绿色荧光报告蛋白。文献报道，IL
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10和TGF
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β可以有效诱导M2型巨噬细胞，是巨噬细胞向M2极化的重要调节细胞因子，并且IL
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10是抑制处于活化的T细胞、B细胞功能最强的调节性细胞因子。TGF
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β能够诱导CD4+CD25
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T细胞分化为Foxp3+调节性T细胞(Treg)细胞，并且维持Foxp3+Treg细胞的免疫抑制功能的重要细胞因子。因此，分泌高水平IL
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10和TGF
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β的脐带间充质干细胞用于骨关节炎的治疗，它将发挥以下几方面的作用：
[0005](1)释放抑制性细胞因子刺激滑膜组织巨噬细胞向M2抑制性巨噬细胞极化，抑制免疫应答，降低炎性细胞因子水平，促进组织修复；
[0006](2)诱导和维持Treg细胞在关节腔的形成和聚集，抑制促炎性免疫细胞反应，调节炎性免疫微环境；
[0007](3)通过干细胞自身的的归巢和释放的生长因子等对损伤组织进行修复。以上三点作用机制将从根本上治愈骨关节炎临床。同时，本专利技术中构建的同时分泌IL
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10和TGF
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β脐带间充质干细胞能够表达荧光报告基因(绿色荧光蛋白EGFP)，可通过活体成像技术实时追踪其在关节腔中的位置、存活时间，迁移等等，从而更方便、准确地检测细胞在关节腔的药代动力学相关参数。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种同时分泌人IL
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10和TGF
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β的可示踪脐带间充质干细胞的制备及其应用，解决了现有技术中缺少一种可同时分泌IL
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10和TGF
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β，其便于追踪的脐带间充质干细胞的问题。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0010]一种同时分泌人IL
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10和TGF
‑
β的可示踪脐带间充质干细胞的制备，包括以下步骤：
[0011]步骤S01：构建pLV
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IL10(P2A)TGFb
‑
EGFP重组慢病毒质粒：通过获取5'端含有EcoR I酶切位点和克扎克序列，3'端包含BamH I酶切位点的IL
‑
10
‑
P2A
‑
TGF
‑
β1多顺反子，来获取IL
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10
‑
P2A
‑
TGF
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β1序列；将合成基因IL10(P2A)TGFb连接至pLV
‑
EF1a
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EGFP(2A)Puro质粒的EcoRI和BamH I之间，得到重组质粒pLV
‑
IL10(P2A)TGFb
‑
EGFP；
[0012]步骤S02：重组包装慢病毒：通过将293T细胞以5*105个细胞/孔的密度接种于含有2mL慢病毒包装培养基的6孔培养板中，置于37℃，5％，CO2条件下孵育细胞过夜，保证转染时细胞密度应达到60
‑
70％汇合，完成细胞接种；然后第二天将所有质粒用Opti
‑
MEM稀释至1ug/ul，进行转染制得重组慢病毒Lenti
‑
IL10(P2A)TGF
‑
β
‑
EGFP，最后进行滴定测定，验证细胞体积；
[0013]步骤S03：制备IL
‑
10/TGF
‑
β分泌型脐带间充质干细胞：
[0014](1)将人脐带间充质干细胞(hUC
‑
MSC)按照1*105/孔接种至含2mL无血清干细胞培养基的6孔板中，将细胞培养板置37℃，5％CO2培养箱孵育；
[0015](2)待细胞密度达到60
‑
70％，按照感染复数MOI＝5加入上述步骤S02中包装的慢病毒Lenti
‑
IL10(P2A)TGF
‑
β
‑
EGFP；
[0016](3)重组慢病毒感染hUC
‑
MSC细胞24小时后，通过荧光显微镜观察绿色荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时分泌人IL
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10和TGF
‑
β的可示踪脐带间充质干细胞的制备，其特征在于，包括以下步骤：步骤S01：构建pLV
‑
IL10(P2A)TGFb
‑
EGFP重组慢病毒质粒：通过获取5'端含有EcoR I酶切位点和克扎克序列，3'端包含BamH I酶切位点的IL
‑
10
‑
P2A
‑
TGF
‑
β1多顺反子，来获取IL
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10
‑
P2A
‑
TGF
‑
β1序列；将合成基因IL10(P2A)TGFb连接至pLV
‑
EF1a
‑
EGFP(2A)Puro质粒的EcoRI和BamH I之间，得到重组质粒pLV
‑
IL10(P2A)TGFb
‑
EGFP；步骤S02：重组包装慢病毒：通过将293T细胞以5*105个细胞/孔的密度接种于含有2mL慢病毒包装培养基的6孔培养板中，置于37℃，5％，CO2条件下孵育细胞过夜，保证转染时细胞密度应达到60
‑
70％汇合，完成细胞接种；然后第二天将所有质粒用Opti
‑
MEM稀释至1ug/ul，进行转染制得重组慢病毒Lenti
‑
IL10(P2A)TGF
‑
β
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EGFP，最后进行滴定测定，验证细胞体积；步骤S03：制备IL
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10/TGF
‑
β分泌型脐带间充质干细胞：(1)将人脐带间充质干细胞(hUC
‑
MSC)按照1*105/孔接种至含2mL无血清干细胞培养基的6孔板中，将细胞培养板置37℃，5％CO2培养箱孵育；(2)待细胞密度达到60
‑
70％，按照感染复数MOI＝5加入上述步骤S02中包装的慢病毒Lenti
‑
IL10(P2A)TGF
‑
β
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EGFP；(3)重组慢病毒感染hUC
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MSC细胞24小时后，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况，判断感染是否成功，并且通过流式细胞检测EGFP的阳性细胞比例；(4)若结果显示，细胞均表达绿色荧光，阳性率达到93％，则说明成功制备IL
‑
10/TGF
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β分泌型脐带间充质干细胞hUC
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MSC
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IL
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10/TGF
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β，可通过荧光示踪。2.根据权利要求1所述的一种同时分泌人IL
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10和TGF
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β的可示踪脐带间充质干细胞的制备，其特征在于，所述步骤S01中，5'端含有EcoR I酶切位点和克扎克序列，3'端包含BamH I酶切位点的IL
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10
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P2A
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TGF
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β1多顺反子的获取，具体包括以下步骤：(1)从NCBI获取IL
‑
10(Homo sapiens)的CDS序列；(2)从NCBI获取TGF
‑
β1(Homo sapiens)的CDS序列；(3)获取P2A序列；(4)根...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏玉龙，吴金芸，叶华衍，孙毅，林靖，
申请(专利权)人：中海峡福建细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：