一种初生仔猪肠神经胶质细胞的分离和原代培养方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种初生仔猪肠神经胶质细胞的分离和原代培养方法，所述方法具体为：步骤1：从屠宰的仔猪上取出空肠前段，进行清洗；步骤2：采用消化培养基消化肠道，收集细胞沉淀；步骤3：向步骤2得到的细胞沉淀中加入胰酶消化肠道，收集细胞沉淀；步骤4：用肠神经胶质细胞培养基重悬步骤3得到的细胞，并接种到用层粘连蛋白和Poly

【技术实现步骤摘要】
一种初生仔猪肠神经胶质细胞的分离和原代培养方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种初生仔猪肠神经胶质细胞的分离和原代培养方法。

技术介绍

[0002]早期断奶仔猪肠道等器官尚未发育成熟，导致其消化能力和抗逆能力较差，加上心理、营养与环境的突然转变，断奶仔猪表现为采食量下降、消化功能紊乱、腹泻、生长受阻等为主要特征的“早期断奶综合症”，给生猪养殖业带来重大经济损失，成为制约生猪规模化养殖的关键问题之一。
[0003]小肠参与机体应激时的病理生理改变，被认为是“多器官功能障碍的发动机”，因此也被称为“机体应激的中心器官”。在应激反应中，动物机体为保证心、脑等重要器官的血液供应，通过复杂的神经
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内分泌系统介导，调节全身血流重新分配，产生选择性内脏血管痉挛，如肠道缺血、缺氧等，进一步引起肠黏膜屏障受损、肠道细菌变化、内毒素群移位、炎性反应及多种细胞因子表达升高。与身体其他器官不同，动物胃肠道具有广泛的内在神经系统，其内在神经系统(被称为肠神经系统，也叫作“肠脑”)可独立于脑和外周自主神经系统对胃肠功能进行调控，具有明显的自律性和稳定性(Vanner et al.,2016；Yoo and Mazmanian,2017)。而且研究表明肠神经系统紊乱会破坏肠道黏膜稳态的平衡进而导致肠道炎症的发生。以往关于仔猪肠道健康的调控研究主要集中于对仔猪肠道屏障功能、免疫细胞、炎症因子以及炎症相关信号通路，但是针对“仔猪肠神经系统
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肠道功能”的研究几乎是空白。肠神经胶质细胞作为肠神经系统的重要组成部分，与肠肠神经胶质细胞构成了肌间神经丛、肠黏膜下层神经丛、肠黏膜固有层神经丛、肠绒毛神经丛等胃肠道内广泛分布的神经网络系统，肠神经胶质细胞的数量大约为肠肠神经胶质细胞4
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10倍(Drokhlyansky et al.,2020；Seguella and Gulbransen,2021)。近年来,有研究将肠神经胶质细胞称为肠道的“小脑”，以凸显其对肠神经系统乃至整个肠道稳态的重要性(Rao and Gershon,2018；Seguella and Gulbransen,2021)。
[0004]困难1：肠神经胶质细胞存在于消化道壁内，提取困难。
[0005]困难2：现有技术中，针对胶质细胞的培养基经过验证，均无法很好的培养肠神经胶质细胞。
[0006]现有的胶质细胞的培养基可见：
[0007]D1：新生大鼠视神经少突胶质细胞原代培养及其对视神经损伤修复研究的意义(英文)，来源：中国临床康复第8卷第4期，2004
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02
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05出版；
[0008]其MATERIALS AND METHODS记载(申请人译文)：从第三军医院附属医院野战外科动物中心获得10只2日龄新生Wistar大鼠，雌雄不限。向基质中加入磷酸盐缓冲液(PBS)、D
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Hanks溶液、DMEM/F12培养基(按照说明配制)、青霉素和链霉素(100kU/L、100mg/L)。然后过滤基质以去除细菌，并将其冷冻备用。聚赖氨酸(西格玛)：1mg/L母液通过PBS配制，然后保持在
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20℃。化学培养液配方：反式铁蛋白(100mg/L)、甲状腺素(0.4mg/L)、亚硒酸钠(40μg/
L)、腐胺购自Sigma公司；谷氨酰胺(3g/L)由华美公司提供；孕酮(0.62mg/L)和胰岛素(0.234ku/L)是我国常用药物。然后用DMEM/F12底物(Hyclone)与青霉素和链霉素(100kU/L，100mg/L)配制上述配方，经过滤去除细菌后冷冻备用。
[0009]D2：CN201810569605.0公开了一种用于体外培养星形胶质细胞的培养基及培养方法，属于细胞培养领域。本专利技术通过在星形胶质细胞培养基中添加表皮生长因子，成纤维细胞生长因子，SAG和Purmorphamine，可以明显的延长星形胶质细胞体外培养时间、增加传代次数、提高纯度、并能保持星形胶质细胞原有特性。专利技术人研究发现，本专利技术的培养基可以隔代使用，并维持星形胶质细胞传代至13代；
[0010]其培养基为：所述培养基是在基础培养基的基础上添加表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、Smo蛋白激动剂Smoothened agonist和Hh激动剂Purmorphamine；
[0011]所述基础培养基中包含有下述组分：5％v/v胎牛血清，Gibco MEM无血清培养基GlutaMAX，1M葡萄糖，50g/L NaHCO3，1％v/v青霉素混合盘尼西林双抗。
[0012]本专利旨在建立一种初生仔猪肠神经胶质细胞的分离和原代培养方法。

技术实现思路

[0013]本专利技术的目的是在于提供一种初生仔猪肠神经胶质细胞的分离和原代培养方法，该方法可成功率高的从仔猪肠道提取得到胶质细胞并原代培养。
[0014]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种初生仔猪肠神经胶质细胞的分离和原代培养方法，所述方法具体为：
[0015]步骤1：从屠宰的仔猪上取出空肠前段，进行清洗；
[0016]步骤2：采用消化培养基消化肠道，收集细胞沉淀；
[0017]步骤3：向步骤2得到的细胞沉淀中加入胰酶消化肠道，收集细胞沉淀；
[0018]步骤4：用肠神经胶质细胞培养基重悬步骤3得到的细胞，并接种到用层粘连蛋白和Poly
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D赖氨酸包被的多孔细胞培养爬片上；
[0019]所述肠神经胶质细胞培养基的配方：
[0020]基础培养基：DMEM/F12培养基；
[0021]FBS 9
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11vol％；
[0022]双抗适量；
[0023]GDNF 95
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105ng/ml；
[0024]100X规格的Glutamax 0.9
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1.1倍体积；
[0025]PDGF 8
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12ng/ml；
[0026]在步骤4的培养过程中，在培养2天后采用无血清的肠神经胶质细胞培养基继续培养；所述无血清的肠神经胶质细胞培养基在肠神经胶质细胞培养基的基础上去除了FBS；
[0027]然后再换回肠神经胶质细胞培养基继续培养。
[0028]在上述的初生仔猪肠神经胶质细胞的分离和原代培养方法中，所述肠神经胶质细胞培养基的配方：
[0029]基础培养基：DMEM/F12培养基；
[0030]FBS 10vol％；
[0031]双抗适量；
[0032]GDNF 100ng/ml；
[0033]100X规格的Glutamax 1倍体积；
[0034]PDGF 10ng/ml。
[0035]在上述的初生仔猪肠神经胶质细胞的分离和原代培养方法中，所述步骤1具体为：
[0036]从屠宰的仔猪上取出空肠前段，使用含3％本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种初生仔猪肠神经胶质细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，所述方法具体为：步骤1：从屠宰的仔猪上取出空肠前段，进行清洗；步骤2：采用消化培养基消化肠道，收集细胞沉淀；步骤3：向步骤2得到的细胞沉淀中加入胰酶消化肠道，收集细胞沉淀；步骤4：用肠神经胶质细胞培养基重悬步骤3得到的细胞，并接种到用层粘连蛋白和Poly
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D赖氨酸包被的多孔细胞培养爬片上；所述肠神经胶质细胞培养基的配方：基础培养基：DMEM/F12培养基；FBS 9
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11vol％；双抗适量；GDNF 95
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105ng/ml；100X规格的Glutamax 0.9
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1.1倍体积；PDGF 8
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12ng/ml；在步骤4的培养过程中，在培养2天后采用无血清的肠神经胶质细胞培养基继续培养；所述无血清的肠神经胶质细胞培养基在肠神经胶质细胞培养基的基础上去除了FBS；然后再换回肠神经胶质细胞培养基继续培养。2.根据权利要求1所述的初生仔猪肠神经胶质细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，所述肠神经胶质细胞培养基的配方：基础培养基：DMEM/F12培养基；FBS 10vol％；双抗适量；GDNF 100ng/ml；100X规格的Glutamax 1倍体积；PDGF 10ng/ml。3.根据权利要求1所述的初生仔猪肠神经胶质细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，所述步骤1具体为：从屠宰的仔猪上取出空肠前段，使用含3％双抗的PBS清洗3
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5遍，直至培养基上清液清亮无杂物，将其置于含1倍体积的Gentamicin/Amphotericin B solution(500X)的含有95％氧气，5％的二氧化碳的Kerbs溶液的培养皿中；Kerbs溶液含126mM NaCl，2.5mM KCl，2.5mM CaCl2，1.2mM NaH2PO4，1.2mM MgCl2，Kerbs溶液的pH为7.0
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7.4。4.根据权利要求1所述的初生仔猪肠神经胶质细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹舒婷，王丽，高靖春，姚康，肖昊，胡胜兰，蒋宗勇，侯磊，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物科学研究所，
类型：发明
国别省市：