新型核碱基编辑器及其使用方法技术

技术编号：33910685 阅读：19 留言：0更新日期：2022-06-25 19:25

本发明专利技术的特征在于新颖可编程核碱基编辑器包含腺苷脱氨酶结构域以及将其用于多核苷酸编辑的方法。在一些实施方案中，可编程核碱基编辑器编辑与遗传疾病相关的致病突变。基编辑器编辑与遗传疾病相关的致病突变。

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【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型核碱基编辑器及其使用方法
[0001]相关申请
[0002]本申请为国际PCT申请，其主张于2019年9月9日提交的美国临时申请号62/897,777的优先权；以及主张于2020年2月13日提交的国际PCT申请号PCT/US2020/018195的优先权，其全部内容以引用方式并入本文。

技术介绍

[0003]核酸序列的靶向编辑，例如，靶向剪切或将特定修饰靶向引入基因组DNA是研究基因功能的一种非常有前景的方法，并且有潜力为人类遗传疾病提供新的治疗方法。目前可用的碱基编辑器包括将靶标C
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G碱基对转换为T
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A的胞苷碱基编辑器(例如，BE4)和将A
·
T转换为G
·
C的腺嘌呤碱基编辑器(例如，ABE7.10)。本领域需要能够以更高的特异性和效率在靶标序列中诱导修饰的改进的碱基编辑器。

技术实现思路

[0004]如下所述，本专利技术的新型可编程核碱基编辑器包含腺苷脱氨酶结构域(例如，TadA*9或ABE9)，以及将其用于多核苷酸编辑的方法。在一些实施方案中，本专利技术的ABE9编辑多核苷酸，例如，多核苷酸包含与遗传疾病相关的致病突变。
[0005]一方面，本专利技术提供的腺苷脱氨酶包含选自由下述所组成的组的氨基酸位置的改变：SEQ ID NO:1的21、23、25、38、51、54、70、71、72、73、94、124、133、139、146，和158，或在另一种腺苷脱氨酶的相应改变：
[0006][0007][0008]在...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种腺苷脱氨酶，其包含选自由下述所组成的组的氨基酸位置的改变：SEQ ID NO:1的21、23、25、38、51、54、70、71、72、73、94、124、133、139、146，和158，或在另一种腺苷脱氨酶的相应改变：2.根据权利要求1所述的腺苷脱氨酶，其包含选自由下述组成的组的改变:SEQ ID NO:1的R21N、R23H、E25F、N38G、L51W、P54C、M70V、Q71M、N72K、Y73S、M94V、P124W、T133K、D139L、D139M、C146R和A158K，或在另一种腺苷脱氨酶的相应改变。3.根据权利要求1或2所述的腺苷脱氨酶,其进一步包含SEQ ID NO:1的V82T改变,或在另一种腺苷脱氨酶的相应改变。4.根据权利要求1至3中任一项所述的腺苷脱氨酶,其包含在选自由下述所组成的组的二个或更多氨基酸位置的改变：所述SEQ ID NO:1的21、23、25、38、51、54、70、71、72、73、94、124、133、139、146和158,或在另一种腺苷脱氨酶的相应改变。5.根据权利要求1至4中任一项所述的腺苷脱氨酶,其包含二个或更多的该改变。6.根据权利要求1至5中任一项所述的腺苷脱氨酶,其中包含三个或更多的该改变。7.根据权利要求1至6中任一项所述的腺苷脱氨酶,其还包含一个或更多的以下的改变:Y147T、Y147R、Q154S、Y123H和Q154R。8.根据权利要求1至7中任一项所述的腺苷脱氨酶,其中，所述腺苷脱氨酶包含任一个以下的组的改变:E25F+V82S+Y123H；T133K+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；L51W+V82S+Y123H+C146R+Y147R+Q154R；Y73S+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；P54C+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；N38G+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；N72K+V82S+Y123H+D139L+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；Q71M+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+P124W+Y147R+Q154R；L51W+V82S+Y123H+C146R+Y147R+Q154R；P54C+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；
Y73S+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；N38G+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；R23H+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R21N+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+Y147R+Q154R+A158K；N72K+V82S+Y123H+D139L+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；M70V+V82S+M94V+Y123H+Y147R+Q154R；Q71M+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；E25F+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；N38G+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R23H+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；P54C+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R21N+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；Y73S+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；E25F+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；N38G+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R23H+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；P54C+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R21N+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；Y73S+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Q154R；N72K+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；Q71M+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R+A158K；M70V+Q71M+N72K+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；N72K_V82S+Y123H+Y147R+Q154R；Q71M_V82S+Y123H+Y147R+Q154R；M70V+V82S+M94V+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R+A158K；或M70V+Q71M+N72K+V82S+Y123H+Y147R+Q154R。9.根据权利要求1至8中任一项所述的腺苷脱氨酶,其包含选自由149、150、151、152、153、154、155、156和157所组成的组的残基开始的C末端的缺失。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的腺苷脱氨酶,其还包含选自由Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、V82S、T166R和Q154R所组成的组的改变。11.根据权利要求1至6任一项所述的腺苷脱氨酶,其为一种表14、表18或图3A至3C所描述的腺苷脱氨酶变体。12.一种融合蛋白，其包含多核苷酸可编程DNA结合结构域和至少一个碱基编辑器结构域，该碱基编辑器结构域是腺苷脱氨酶变体，其包含在选自下述所组成的组的氨基酸位置的改变：SEQ ID NO 1的21、23、25、38、51、54、70、71、72、73、94、124、133、139、146和158，或在另一种腺苷脱氨酶的相应改变：13.根据权利要求12所述的腺苷脱氨酶变体，其中，所述的腺苷脱氨酶变体包含选自由下述所组成的组的改变:SEQ ID NO:1的R21N、R23H、E25F、N38G、L51W、P54C、M70V、Q71M、N72K、Y73S、M94V、P124W、T133K、D139L、D139M、C146R和A158K，或在另一种腺苷脱氨酶的相应改变。14.一种融合蛋白，其包含多核苷酸可编程DNA结合结构域和至少一个碱基编辑器结构域，该碱基编辑器结构域是腺苷脱氨酶变体，其包含选自下述所组成的组的改变：SEQ ID NO 1的R21N,R23H,E25F,N38G,L51W,P54C,M70V,Q71M,N72K,Y73S,M94V,P124W,T133K,D139L,D139M,C146R,和A158K,或在另一种腺苷脱氨酶的相应改变。15.根据权利要求12至14中任一项所述的融合蛋白，其中，所述腺苷脱氨酶变体还包含SEQ ID NO：1的V82T改变，或在另一种腺苷脱氨酶的相应改变。16.一种融合蛋白，其包含多核苷酸可编程DNA结合结构域和至少一个碱基编辑器结构域，该碱基编辑器结构域是腺苷脱氨酶变体，其包含V82T的改变和一个或多个选自下述所组成的组的改变：所述SEQ ID NO 1的R21N,R23H,E25F,N38G,L51W,P54C,M70V,Q71M,N72K,Y73S,M94V,P124W,T133K,D139L,D139M,C146R,和A158K,或在另一种腺苷脱氨酶的相应改变。17.根据权利要求12至16中任一项所述的融合蛋白，所述腺苷脱氨酶变体包含选自由下述所组成的组的两个或更多个氨基酸位置的改变：所述SEQ ID NO:1的21、23、25、38、51、54、70、71、72、73、94、124、133、139、146和158，或在另一种腺苷脱氨酶的相应改变。18.根据权利要求12至17中任一项所述的融合蛋白，其中，所述腺苷脱氨酶变体包含二个或更多个该改变。19.根据权利要求12至17中任一项所述的融合蛋白，其中所述腺苷脱氨酶变体包含三
个或更多个该改变。20.根据权利要求12至19中任一项所述的融合蛋白，其中所述腺苷脱氨酶变体还包含以下一个或多个改变：Y147T、Y147R、Q154S、Y123H和Q154R。21.根据权利要求12至20中任一项所述的融合蛋白，其中，所述腺苷脱氨酶变体包含任一个以下的组的改变:E25F+V82S+Y123H；T133K+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；L51W+V82S+Y123H+C146R+Y147R+Q154R；Y73S+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；P54C+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；N38G+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；N72K+V82S+Y123H+D139L+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；Q71M+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+P124W+Y147R+Q154R；L51W+V82S+Y123H+C146R+Y147R+Q154R；P54C+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；Y73S+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；N38G+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；R23H+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R21N+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+Y147R+Q154R+A158K；N72K+V82S+Y123H+D139L+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；M70V+V82S+M94V+Y123H+Y147R+Q154R；Q71M+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；E25F+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；N38G+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R23H+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；P54C+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R21N+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；Y73S+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；E25F+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；
N38G+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R23H+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；P54C+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R21N+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；Y73S+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Q154R；N72K+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；Q71M+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R+A158K；M70V+Q71M+N72K+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；N72K+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；Q71M+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；M70V+V82S+M94V+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R+A158K；或M70V+Q71M+N72K+V82S+Y123H+Y147R+Q154R。22.根据权利要求12至20中任一项所述的融合蛋白，其中，所述腺苷脱氨酶变体包含选自由149、150、151、152、153、154、155、156和157组成的组中的残基开始的C末端的缺失。23.根据权利要求12至20中任一项所述的融合蛋白，其中，所述碱基编辑器结构域包含腺苷脱氨酶变体单体，其中，所述腺苷脱氨酶单体包含一个或更多个选自下述所组成的组的改变：SEQ ID NO 1的R21N,R23H,E25F,N38G,L51W,P54C,M70V,Q71M,N72K,Y73S,V82T、M94V、P124W、T133K、D139L、D139M、C146R、和A158K。24.根据权利要求12至17中任一项所述的融合蛋白，其中，所述碱基编辑器结构域包含腺苷脱氨酶异二聚体，所述腺苷脱氨酶异二聚体包含野生型腺苷脱氨酶结构域和腺苷脱氨酶变体。25.根据权利要求24所述的融合蛋白，其中，所述腺苷脱氨酶变体还包含选自由下述所组成的组的改变：Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、V82S、T166R和Q154R。26.根据权利要求12至17中任一项所述的融合蛋白，其中，所述碱基编辑器结构域包含腺苷脱氨酶异二聚体，所述异二聚体包含TadA*7.10结构域和腺苷脱氨酶变体结构域。27.根据权利要求26所述的融合蛋白，其中，所述腺苷脱氨酶变体还包含二个或更多个该改变。28.根据权利要求12至17中任一项所述的融合蛋白，其中，所述碱基编辑器包含异二聚体，所述异二聚体包含TadA*7.10结构域和腺苷脱氨酶变体，所述腺苷脱氨酶变体包含任一个以下的组的改变:E25F+V82S+Y123H；T133K+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；
L51W+V82S+Y123H+C146R+Y147R+Q154R；Y73S+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；P54C+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；N38G+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；N72K+V82S+Y123H+D139L+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；Q71M+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+P124W+Y147R+Q154R；L51W+V82S+Y123H+C146R+Y147R+Q154R；P54C+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；Y73S+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；N38G+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；R23H+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R21N+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+Y147R+Q154R+A158K；N72K+V82S+Y123H+D139L+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；M70V+V82S+M94V+Y123H+Y147R+Q154R；Q71M+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；E25F+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；N38G+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R23H+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；P54C+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R21N+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；Y73S+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；E25F+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；N38G+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R23H+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；P54C+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R21N+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；Y73S+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Q154R；N72K+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；
Q71M+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R+A158K；M70V+Q71M+N72K+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；N72K+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；Q71M+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；M70V+V82S+M94V+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R+A158K；或M70V+Q71M+N72K+V82S+Y123H+Y147R+Q154R。29.根据权利要求12至17中任一项所述的融合蛋白，其中，所述腺苷脱氨酶变体是表14、表18或图3A至3C中描述的ABE9或TadA*9脱氨酶变体。30.根据权利要求12至29中任一项所述的融合蛋白，其中，所述腺苷脱氨酶变体是截短的ABE8或ABE9，其缺失相对于全长ABE9的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19或20个C
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末端氨基酸残基。31.根据权利要求12至30中任一项所述的融合蛋白，其中，所述多核苷酸可编程DNA结合结构域是Cas9、Cas12a/Cpf1、Cas12b/C2c1、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、Cas12i或Cas12j/CasΦ结构域。32.一种融合蛋白，其包含多核苷酸可编程DNA结合结构域，所述多核苷酸可编程DNA结合结构域包含以下序列：EIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFMQPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAKFLQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPRAFKYFDTTIARKEYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGMDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEGADKRTADGSEFESPKKKRKV*,其中粗体序列表示源自Cas9的序
列，斜体序列表示接头序列，加下划线的序列表示二分核定位序列，并且至少一个碱基编辑器结构域包含腺苷脱氨酶变体，所述变体包含在选自由下述所组成的组的氨基酸位置的改变：SEQ ID NO 1的21、23、25、38、51、54、70、71、72、73、94、124、133、138、139、146和158。33.根据权利要求32所述的腺苷脱氨酶变体，其中，所述腺苷脱氨酶变体包含选自由下述所组成的组的改变:SEQ ID NO:1的R21N、R23H、E25F、N38G、L51W、P54C、M70V、Q71M、N72K、Y73S、M94V、P124W、T133K、D138M、D139L、D139M、C146R和A158K。34.根据权利要求33所述的融合蛋白，其中，所述腺苷脱氨酶变体包含SEQ ID NO：1的V82T改变。35.根据权利要求33或34所述的融合蛋白，其中，所述腺苷脱氨酶变体包含二个或更多个该改变。36.根据权利要求33或34所述的融合蛋白，其中，所述腺苷脱氨酶变体包含三个或更多个该改变。37.根据权利要求33或34所述的融合蛋白，其中，所述腺苷脱氨酶变体还包含选自由下述所组成的组的改变:Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、V82S、T166R和Q154R。38.根据权利要求33或34所述的融合蛋白，其中，所述腺苷脱氨酶变体包含二个或更多个以下改变：Y147T、Y147R、Q154S、Y123H和Q154R。39.根据权利要求32项所述的融合蛋白，其中，所述腺苷脱氨酶变体包含任一个以下的组的改变:E25F+V82S+Y123H；T133K+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；L51W+V82S+Y123H+C146R+Y147R+Q154R；Y73S+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；P54C+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；N38G+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；N72K+V82S+Y123H+D139L+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；Q71M+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R；E25F+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+P124W+Y147R+Q154R；L51W+V82S+Y123H+C146R+Y147R+Q154R；P54C+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；Y73S+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；N38G+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；R23H+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R21N+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+Y147R+Q154R+A158K；N72K+V82S+Y123H+D139L+Y147R+Q154R；
E25F+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；M70V+V82S+M94V+Y123H+Y147R+Q154R；Q71M+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；E25F+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；N38G+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R23H+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；P54C+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R21N+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；Y73S+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；E25F+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82T+Y123H+Y147R+Q154R；N38G+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R23H+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；P54C+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；R21N+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；I76Y+V82S+Y123H+D139M+Y147R+Q154R；Y73S+I76Y+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Q154R；N72K+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；Q71M+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R+A158K；M70V+Q71M+N72K+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；N72K+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；Q71M+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；M70V+V82S+M94V+Y123H+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R；V82S+Y123H+T133K+Y147R+Q154R+A158K；M70V+Q71M+N72K+V82S+Y123H+Y147R+Q154R；或或表14的任何其他改变或其的组。40.根据权利要求12至39中任一项所述的融合蛋白，其中，所述多核苷酸可编程DNA结合结构域是金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)、嗜热链球菌1Cas9(St1Cas9)、化脓性链球菌Cas9(SpCas9)或其变体。41.根据权利要求12至40中任一项所述的融合蛋白，其中，所述多核苷酸可编程DNA结合结构域包含经修饰的SaCas9，其具有改变的原间隔序列相邻基序(PAM)特异性。42.根据权利要求41所述的融合蛋白，其中，所述经修饰的SaCas9包含氨基酸取代E782K、N968K和R1015H，或其相应的氨基酸取代。
43.根据权利要求12至40中任一项所述的融合蛋白，其中，所述多核苷酸可编程DNA结合结构域包含SpCas9的变体，其具有经改变的原间隔序列相邻基序(PAM)特异性。44.根据权利要求43所述的融合蛋白，其中所述经改变的PAM对核酸序列5'
‑
NGA
‑
3'、5'
‑
NGC
‑
3'、5'
‑
NGG
‑
3'、5'
‑
NGT
‑
3'或5
”‑
NGN
‑
3'具有特异性。45.根据权利要求43或44所述的融合蛋白，其中，所述变体SpCas9包含选自以下的氨基酸取代：D1135M、S1136Q、G1218K、E1219F、A1322R、D1332A、R1335E和T1337R，或其相应的氨基酸取代；I322V、S409I、E427G、R654L、R753G、(MQKFRAER)或其相应的氨基酸取代；I322V、S409I、E427G、R654L、R753G、R1114G或其相应的氨基酸取代；或如...

【专利技术属性】
技术研发人员：N，
申请(专利权)人：比姆医疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：

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