用于生产乙醇的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于生产乙醇的方法，所述方法包括用重组酵母发酵碳源组合物，其中所述碳源组合物包含至少葡萄糖和阿拉伯糖；并且其中所述重组酵母包含阿拉伯糖异构酶活性、核酮糖激酶活性、磷酸核酮糖差向异构酶活性、甘油摄取活性和甘油转换能力；并且其中所述重组酵母还包含导致具有甘油流出活性的同源蛋白的活性降低、下调、抑制和/或消除的遗传修饰；并且其中所述葡萄糖和所述阿拉伯糖中的每一者都被转换成乙醇。此外，本发明专利技术涉及一种可用于此类方法的重组酵母。此类方法的重组酵母。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产乙醇的方法


[0001]本专利技术涉及一种用于生产乙醇的方法。

技术介绍

[0002]生物乙醇是一种补充或甚至替代基于化石的运输用燃料的可持续方式，因为它结合了低碳足迹和与当前内燃机技术的兼容性。
[0003]第一代生物乙醇与1.5代或第二代生物乙醇之间有区别。所谓的第一代工业生物乙醇生产方法例如基于水解玉米淀粉或甘蔗蔗糖的发酵。葡萄糖，一种己糖，是由此类玉米淀粉或甘蔗蔗糖水解产生的主要糖产物。这种葡萄糖随后可用酵母发酵以产生乙醇。
[0004]所谓的1.5代或第二代生物乙醇可由含纤维素和/或半纤维素的生物质生产。特别是植物生物质的级分的水解在经济上是有吸引力的。植物生物质的级分可水解成包含不同类型的游离单糖(包括己糖和/或戊糖)的水解产物。此类己糖(即六碳糖)的示例是葡萄糖。戊糖(即五碳糖)的示例包括木糖和阿拉伯糖。此外，此类水解产物可含有甘油和/或乙酸。
[0005]第二代乙醇生产中的主要挑战是包含在此类水解产物中的混合碳源(例如葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘油和/或乙酸)的发酵。
[0006]酵母是乙醇工业中选择的生物体，但是例如常用的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)不能利用生物质原料的半纤维素组分中所包含的五碳(C5)糖。半纤维素可占生物质的20
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30％，其中木糖和阿拉伯糖是最丰富的五碳糖。可以对酵母进行遗传修饰以增加发酵例如五碳糖的能力，但是混合碳源组合物的转换需要多种遗传修饰，其中一种修饰可能影响另一种修饰，反之亦然。此外，对于每种不同的碳源，转换率可能不同。
[0007]另一个主要挑战是葡萄糖阻遏方面。葡萄糖阻遏是指生长在葡萄糖上的酵母细胞阻遏替代碳源的代谢所需的许多基因的表达的现象。在混合糖组合物的现有技术发酵中，酵母优先利用葡萄糖，而木糖和阿拉伯糖仅在葡萄糖几乎完全耗尽时才被使用。
[0008]US9551015描述了葡萄糖阻遏现象和从包含葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的糖组合物生产发酵产物如乙醇的方法。所述方法包括：a)在属于酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Kloeckera)、许旺酵母属(Schwanniomyces)和/或耶氏酵母属(Yarrowia)的重组酵母存在下发酵所述糖组合物，以及b)回收所述发酵产物，其中所述重组酵母包含基因araA、araB和araD，其中所述葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖中的每一这个被转换成至少一种发酵产物，例如乙醇。
[0009]尽管用US9551015中所述的酵母细胞和方法获得了商业上令人感兴趣的结果，但是期望具有戊糖如阿拉伯糖的更快和/或更完全的转换。可能还期望转换除上述糖以外的碳源，例如甘油和/或乙酸或其任何乙酸盐。
[0010]WO2015/028583描述了经遗传修饰的酵母细胞，该经遗传修饰的酵母细胞包含：a)一个或多个编码甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)的核酸序列；b)一个或多个编码二羟基丙酮激酶(E.C.2.7.1.28或E.C.2.7.1.29)的核酸序列，和c)一个或多个编码甘油转运体的核酸序
列。此外，细胞可包含一个或多个编码NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶的核酸序列。WO2015/028583进一步描述了一种方法，该方法包括从乙酸盐和从可发酵碳水化合物—特别是选自由葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖组成的组的碳水化合物—制备发酵产物，该制备在厌氧条件下使用上述酵母细胞进行。
[0011]WO2015/028583解释说，由于乙酸往往被认为是水解产物中存在的最毒化合物，因此希望进一步降低水解产物中的乙酸盐(乙酸)浓度。提到一种增加酵母的厌氧乙酸转换潜力的方式是通过引入甘油转换途径，该甘油转换途径例如转换外部添加的甘油，从而迫使酵母细胞转换更多的乙酸来维持氧化还原平衡。
[0012]在实施例和表11中，WO2015/028583说明了特别是转化体T5，包括来源于鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycs rouxii)的甘油转运体STL1，导致相对于参照菌株更多甘油的转换。也消耗了更多的乙酸。然而，在这种T5的情况下，乙醇效价不是最高的，因为不是所有的糖都被消耗掉了。因此，尽管用WO2015/028583中描述的酵母细胞和方法获得了良好的结果，但仍有进一步改进的空间，例如在戊糖(例如木糖和/或阿拉伯糖)的转换中。
[0013]Kyung Ok Yu等人在他们发表于Journal of Biotechnology第150卷(2010)，第209
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214页的题为“Reduction of glycerol production to improve ethanol yield in an engineered Saccharomyces cerevisiae using glycerol as a substrate”的文章中描述了一种经遗传修饰的酵母菌株。为了提高乙醇生产率，使天然甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶过表达，并使基因FPS1和GPD2缺失。所述菌株仅在葡萄糖上进行了测试，并且没有研究所述菌株对于混合碳源(例如还包含戊糖、甘油和/或乙酸或乙酸盐)转换的适用性。
[0014]WO2015/023989描述了一种重组微生物，所述重组微生物包含：作为组分a)的一种或多种天然和/或异源蛋白，其功能是将甘油导入重组微生物中，其中所述一种或多种天然和/或异源蛋白质被激活、上调或过表达；和作为组分b)的一种或多种天然和/或异源酶，其在一种或多种经工程化的代谢途径中起作用以将碳水化合物源转换成醇，其中所述一种或多种天然和/或异源酶被激活、上调、过表达或下调。
[0015]作为组分a)的一个示例，WO2015/023989的说明书提到了酿酒酵母甘油活性转运体，并且顺便提及了来自其他酵母(例如白假丝酵母(C.albicans)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)和毕赤酵母(Pichia sorbitophila))的一些异源转运体。对于组分b)，文中提到了几种不同的替代品。
[0016]WO2015/0023989提到重组微生物可进一步包含一种或多种天然和/或异源蛋白，其功能是从微生物输出甘油，其中所述一种或多种天然和/或异源酶可被激活、上调或下调。说明书提到FPS1是此类酶的示例。然而，在工作实施例中没有例示FPS1的激活、上调或下调，并且没有解释其功能。
[0017]WO2015/023989中例示的经遗传修饰的菌株在葡萄糖上以及葡萄糖、蔗糖和果糖的混合物上(即在甘蔗糖浆和甘蔗糖蜜上)进行测试。图17B进一步说明了经遗传修饰的菌株中的一种经遗传修饰的菌株的甘油减少，但是这种经遗传修饰的菌株的活力似乎降低了，如图17C所示。没有研究菌株用于转换混合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于生产乙醇的方法，所述方法包括用重组酵母发酵碳源组合物，其中所述碳源组合物包含至少葡萄糖和阿拉伯糖；并且其中所述重组酵母包含阿拉伯糖异构酶活性、核酮糖激酶活性、磷酸核酮糖差向异构酶活性、甘油摄取活性和甘油转换能力；并且其中所述重组酵母还包含导致具有甘油流出活性的同源蛋白的活性降低、下调、抑制和/或消除的遗传修饰；并且其中所述葡萄糖和所述阿拉伯糖中的每一者都被转换成乙醇。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组酵母包含编码具有阿拉伯糖异构酶活性的异源蛋白的细菌基因；编码具有核酮糖激酶活性的异源蛋白的细菌基因；以及编码具有磷酸核酮糖差向异构酶活性的异源蛋白的细菌基因。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述重组酵母包含编码具有甘油
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质子同向转运体活性的异源蛋白的耐葡萄糖基因。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述重组酵母包含一个或多个耐葡萄糖STL基因。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述重组酵母包含一个、两个或更多个拷贝的编码一种或多种具有木糖异构酶活性的蛋白质的异源基因；和/或一个、两个或更多个拷贝的编码一种或多种具有木糖还原酶活性的蛋白质的异源基因；和/或一个、两个或更多个拷贝的编码一种或多种具有木糖醇脱氢酶活性的蛋白质的异源基因。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述重组酵母中的一种或多种具有甘油流出活性的同源水甘油通道蛋白的活性被降低、抑制或消除。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述重组酵母中的同源fps1的活性被降低、抑制或消除。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述重组酵母的同源FPS1基因被破坏或敲除。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述碳源组合物包含至少葡萄糖、阿拉伯糖和甘油；并且其中所述重组酵母包含阿拉伯糖异构酶活性、核酮糖激酶活性和磷酸核酮糖差向异构酶活性、甘油脱氢酶活性、二羟基丙酮激酶活性和甘油
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【专利技术属性】
技术研发人员：英格丽德，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：