检测引起急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌有毒性或无毒性的方法技术

本发明专利技术涉及监测虾的急性肝胰腺坏死病领域。更具体地，本发明专利技术公开了检测碱性磷酸酶Phox酶的存在，或引起急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌的PiRAvp和/或PirBvp毒素的存在，分别与所述细菌的无毒性或毒性相关联。因此，能够检测所述Phox酶和/或所述毒素的测定对于监测虾中的所述疾病可能非常有用。虾中的所述疾病可能非常有用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测引起急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌有毒性或无毒性的方法


[0001]本专利技术涉及监测虾的急性肝胰腺坏死病领域。更具体地，本专利技术公开了检测碱性磷酸酶Phox酶的存在，或引起急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌的PiRA
VP
和/或PirB
VP
毒素的存在，分别与所述细菌的无毒性或毒性相关联。因此，能够检测所述Phox酶和/或所述毒素的测定对于监测虾中的所述疾病可能非常有用。

技术介绍

[0002]革兰氏阴性海洋细菌副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是重要的水生病原体，并且一些菌株能够引起虾水产养殖中的急性肝胰腺坏死病(AHPND)和其他重要疾病(Jayasree等人，2006；Li等人，2017)。受AHPND影响的地区的虾产量有时大幅下降(至～60％)，并且疾病每年给全球虾养殖业造成10亿美元的损失(Lee等人，2015；Nunan等人，2014)。一些副溶血弧菌菌株确实含有pVA1质粒(63
‑
70kb)，该质粒编码命名为PirA
VP
和PirB
VP
的二元毒素，它们与发光杆菌(Photorhabdus luminescens)昆虫相关(Pir)毒素PirA/PirB同源(Campa
‑
C
ó
rdova等人，2017；Gomez
‑
gil等人，2014；Han等人，2015；Lee等人，2015)。PirA
VP
和PirB
>VP
毒素是介导虾中AHPND病因和死亡率的细菌的主要毒性因子(Campa
‑
C
ó
rdova等人，2017；Dong等人，2017；Kumar等人，2018))
[0003]然而，后一种毒性表型是否可以转变为无毒性表型以及是否可以通过易于使用的测定测量每种表型分泌的产物来轻松区分所述表型是完全未知的。这种测定对于监测例如虾中的AHPND将非常有用。
附图说明
[0004]图1来自不同培养条件的副溶血弧菌细胞外蛋白(VP
AHPND ECP)的考马斯染色SDS
‑
PAGE凝胶，(i)VP
AHPND ECP从副溶血弧菌M0904培养物纯化，持续搅拌(120min
‑1)且无絮凝物形成，在13和50kDa处显示两条明显条带(泳道1
‑
4，显示4次重复培养的结果)。(ii)在持续搅拌(110min
‑1)和高度絮凝下，从副溶血弧菌M0904培养物纯化的VP
AHPND ECP在73kDa处显示单条明显条带(泳道1
‑
4，显示4次重复培养的结果)。
[0005]图2毒性AHPND质粒基因的表达：在不同培养条件下培养的副溶血弧菌M0904菌株的A
‑
ORF14、B
‑
PirB
VP
和负责絮凝物形成的基因：C
‑
碱性磷酸酶PhoX。副溶血弧菌M0904菌株在20ml海生菌肉汤中以110min
‑1(高度絮凝)或120min
‑1(无絮凝物形成)持续搅拌孵育过夜。在12和24h后收集来自两种培养条件的样品用于基因表达测定。对于毒性AHPND质粒基因，在絮凝物形成组中的表达设置为1。然而，对于碱性磷酸酶PhoX基因，在无絮凝物形成组中的表达设置为1。结果为平均值
±
SE(n＝3)，并表示为相对于副溶血弧菌toxR和rpoA mRNA。星号表示有絮凝物(110rpm)和无絮凝物(120rpm)的副溶血弧菌M0904培养物之间的显著性差异*(P<0.05)，**(P<0.01)，***(P<0.001)，****(P<0.0001)，*****(P<0.00001)。
[0006]图3(A)盐水虾幼虫接受在20ml海生菌肉汤中以120min
‑1或110min
‑1持续搅拌孵育
过夜的副溶血弧菌M0904培养物挑战48h后的存活率(％)。幼虫接受以107个细胞/ml饲养水的副溶血弧菌挑战。未挑战的幼虫用作阴性对照。误差线代表五次重复的标准误差；不同字母表示显著性差异(P<0.001)。
[0007](B)盐水虾幼虫接受从副溶血弧菌M0904培养物浓缩的1.3、1.95、2.6和3.9μg的VP
AHPND
细胞外蛋白(ECP)挑战60h后的存活率(％)，该副溶血弧菌M0904培养物与PirA
VP
和PirB
VP
毒素以120min
‑1持续搅拌孵育或与碱性磷酸酶PhoX以110min
‑1持续搅拌孵育。未挑战的幼虫用作阴性对照。误差线代表三次重复的标准误差；不同字母表示显著性差异(P<0.001)。
[0008](C)盐水虾幼虫接受1.3、1.95、2.6和3.9μg的VP
AHPND
纯化的PirA
VP
和PirB
VP
毒素或VP
AHPND
纯化的碱性磷酸酶PhoX挑战60h后的存活率(％)。未挑战的幼虫用作阴性对照。误差线代表三次重复的标准误差；不同字母表示显著性差异(P<0.001)。
[0009]图4沼虾(Macrobrachium)幼虫(8日龄)接受在20ml海生菌肉汤(MB)中以120min
‑1或110min
‑1持续搅拌孵育培养过夜的副溶血弧菌M0904培养物挑战12、24、36和48h后的存活率(％)。幼虫接受以106个细胞/ml饲养水的副溶血弧菌挑战。未挑战的幼虫用作阴性对照。值表示为平均值
±
SE(n＝3)。星号表示接受110rpm或120rpm min
‑1M0904培养物挑战的处理组之间的显著性差异*(P<0.05)，**(P<0.01)，***(P<0.001)，****(P<0.0001)，*****(P<0.00001)，******(P<0.000001)，*******(P<0.0000001)。
具体实施方式
[0010]本专利技术公开了低振荡速度可以触发副溶血弧菌的表型转换，尤其是介导对虾的毒性变化。本专利技术确实表明副溶血弧菌在较低振荡速度下下调PirAB
VP
毒素表达，同时产生和分泌碱性磷酸酶PhoX酶。因此，本专利技术显示副溶血弧菌根据环境条件表现出不同的表型：毒性和无毒性表型。
[0011]因此，本专利技术首先涉及使用副溶血弧菌的碱性磷酸酶Phox作为所述副溶血弧菌作为无毒性表型的标志物。
[0012]术语“副溶血弧菌”是指革兰氏阴性海洋细菌的所有菌株，其是重要的水生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.副溶血弧菌的碱性磷酸酶Phox酶作为确定所述副溶血弧菌为无毒性表型的标志物的用途。2.根据权利要求1所述的用途，用于监测虾的急性肝胰腺坏死病。3.与副溶血弧菌的碱性磷酸酶Phox酶结合的分子用于确定所述副溶血弧菌为无毒性表型的用途。4.根据权利要求3所述的分子的用途，其中所述分子是与副溶血弧菌的碱性磷酸酶Phox酶结合的抗体或其片段。5.一种测定，所述测定包括与副溶血弧菌的碱性磷酸酶Pox酶结合的抗体或其片段，以及包括与副溶血弧菌的PiRA
VP
和/或PirB
VP
毒素结合的抗体或其片段。6.根据权利要求5所述的测定，其用于确定所述副溶血弧菌为无毒性或为毒性表型。7.根据权利要求5
‑
6所述的测定，其中所述测定是侧流免疫层析测定或酶联免疫吸附测定。8.一种用于确定所述副溶血...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得，
申请(专利权)人：根特大学，
类型：发明
国别省市：