一种脱水四环素诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌通用型诱导表达系统技术方案

本发明专利技术公开了一种脱水四环素诱导的大肠杆菌

【技术实现步骤摘要】
一种脱水四环素诱导的大肠杆菌
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枯草芽孢杆菌通用型诱导表达系统


[0001]本专利技术了涉及一种脱水四环素诱导的大肠杆菌
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枯草芽孢杆菌通用型诱导表达系统，属于基因工程学领域。

技术介绍

[0002]枯草芽孢杆菌作为一类革兰氏阳性菌，由于其良好的生物安全性，较强的分泌能力，无密码子偏好性而被广泛应用与各种蛋白酶制剂和有价值的蛋白质的生产。枯草芽孢杆菌表达异源蛋白存在多种表达系统，以不同启动子特性来分，主要有自诱导表达系统、组成型表达系统、诱导型表达系统。启动子从功能上主要分为组成型启动子和诱导型启动子两类。组成型启动子在菌体的生长各个阶段都可以表达外源基因，而诱导型启动子在没有被诱导时表现无活性或者低活性，在加入诱导剂之后启动子的活性大幅提高进而高效表达外源基因。诱导型启动子由于其活性可控而被广泛应用，人们可以通过调控加入诱导剂的试剂和浓度控制外源基因的表达时间和强度。
[0003]目前在枯草芽孢杆菌当中应用较为广泛的主要有IPTG诱导系统和木糖诱导系统。其中，IPTG诱导系统主要基于pHT系列载体构建而成，使用的是非天然的杂合启动子和大肠杆菌的LacI阻遏蛋白和结合位点；而木糖诱导系统通常使用天然的PxylA启动子和XylR阻遏蛋白。虽然IPTG、木糖等诱导系统在枯草芽孢杆菌中被广泛使用，但由于木糖是碳源会被利用、IPTG对人体有毒、表达强度有限、在大肠杆菌中是组成型表达无法诱导等缺点，在实际使用中均出现一定的问题；如在表达一些对菌体产生毒性的蛋白时，在大肠杆菌中的泄漏表达经常使基因序列发生突变而提前终止表达，无法构建大肠
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枯草通用诱导调控系统。
[0004]因此，需要开发一种基于新型诱导剂、调控严谨、在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中通用的诱导型表达系统，对后续酶工程、代谢工程等领域打下基础。

技术实现思路

[0005]枯草芽孢杆菌中常用的IPTG、木糖等诱导系统在大肠杆菌中组成型表达无法诱导，不利于蛋白表达载体的构建与调控系统的构建；通用诱导型表达系统要求阻遏蛋白要在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表现出足够的亲和强度和表达强度以降低启动子的泄漏使调控更严谨。
[0006]本专利技术提供了一种阻遏蛋白tetR表达框，所述表达框由启动子P21、RBS序列和阻遏蛋白tetR构成；所述启动子P21的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述RBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.9所示，所述阻遏蛋白tetR的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或阻遏蛋白为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的阻遏蛋白tetR的第119位的苯丙氨酸突变为酪氨酸得到的。
[0007]本专利技术还提供了一种表达系统，所述表达系统由表达载体、上述表达框及目的基因构成，所述目的基因含有P
tet
启动子。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述目的基因包括但不限于超级折叠绿色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、β
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葡萄糖醛酸苷酶、β
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半乳糖苷酶或参与微生物代谢调控的基因。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体包括但不限于pHT01质粒、pSTOP1622质粒、pJOE8999质粒或pAD123质粒。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述P
tet
启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0011]本专利技术还提供了一种重组细胞，所述重组细胞中含有上述阻遏蛋白tetR表达框，或上述表达系统。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为表达宿主。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于E.coli JM109、E.coli JM110、E.coli DH5α或E.coli BL21；所述枯草芽孢杆菌但不限于B.subtilis 168、WB600、WB800。
[0014]本专利技术还提供了上述阻遏蛋白tetR表达框在采用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌进行目的基因表达中的应用，所述目的基因含有P
tet
启动子。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述目的基因包括但不限于超级折叠绿色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、β
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葡萄糖醛酸苷酶、β
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半乳糖苷酶或参与微生物代谢调控的基因。
[0016]本专利技术还提供了一种脱水四环素诱导的大肠杆菌
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枯草芽孢杆菌通用型诱导表达质粒pHT
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P
21
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tet
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RBS
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P
tet
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sfGFP及其构建方法。
[0017]在本专利技术的一种实施方案中，通用型诱导表达质粒pHT
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P
21
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tet
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RBS
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P
tet
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sfGFP主要由三部分构成：商业化质粒pHT01表达载体、阻遏蛋白tetR表达框、超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)表达框。
[0018]在本专利技术的一种实施方案中，阻遏蛋白tetR表达框由枯草芽孢杆菌组成型启动子P21、RBS原始序列和阻遏蛋白基因tetR构成，阻遏蛋白基因tetR的Genbank登录号为CAA25291，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，组成型启动子P21的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，RBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0019]在本专利技术的一种实施方案中，超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)表达框由诱导型启动子P
tet
、RBS
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sfGFP
与超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)组成，超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)的Genbank登录号为BAP77013.1，该基因已按照B.subtilis的密码子偏好性进行优化，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，诱导型启动子P
tet
的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，RBS1序列如SEQ ID NO.8。
[0020]本专利技术还提供了一种脱水四环素诱导的大肠杆菌
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枯草芽孢杆菌通用型诱导表达质粒pHT
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P
21
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F119Y
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RBS0
‑
P
tet
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sfGFP及其构建方法，以上述质粒pHT
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P
21
‑
tet
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RBS
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P
tet
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sf本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种阻遏蛋白tetR表达框，其特征在于，所述表达框由启动子P21、RBS序列和阻遏蛋白tetR构成；所述启动子P21的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述RBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.9所示，所述阻遏蛋白tetR的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或阻遏蛋白为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的阻遏蛋白tetR的第119位的苯丙氨酸突变为酪氨酸得到的。2.一种表达系统，其特征在于，所述表达系统由表达载体、权利要求1所述的表达框及目的基因构成，所述目的基因含有P
tet
启动子。3.如权利要求2所述的表达系统，其特征在于，所述目的基因包括但不限于超级折叠绿色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、β
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葡萄糖醛酸苷酶、β
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半乳糖苷酶或参与微生物代谢调控的基因。4.如权利要求2或3所述的表达系统，其特征在于，所述表达载体包括但不限于pHT01质粒、pSTOP1622质粒、pJOE8999质粒或pAD123质粒。5.如权利要求4所述的表...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，吕雪芹，堵国成，李江华，刘延峰，李洋，武耀康，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：