基于DNA纳米技术的pMHC多聚体制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了基于DNA纳米技术的pMHC多聚体制备方法及其应用。本发明专利技术利用DNA纳米结构作为支架，连接不同数量的pMHC，并控制其数量、位置和方向，使用原子力显微镜可以清晰地观察到不同数量的pMHC被捕获和展示在DNA纳米结构上。使用DNA

【技术实现步骤摘要】
基于DNA纳米技术的pMHC多聚体制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于T细胞检测领域，具体地说，涉及一种基于DNA纳米技术的pMHC多聚体制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]CTL是机体介导细胞免疫的主要效应细胞，是适应性细胞免疫的核心。在机体清除细胞内病原体感染，抗肿瘤和排斥移植物等反应中发挥着重要的生物学作用。抗原特异CTL是一小群极重要的细胞，但由于它们在淋巴细胞中的百比非常低，因此使得这群有重要意义的细胞的检测非常困难。准确监测疾病进展和评估疫苗效力需要高效、特异性和定量检测抗原特异性T细胞。
[0003]合成的肽
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主要组织相容性复合物(pMHC)可以与抗原特异性T细胞表面的T细胞受体(TCR)结合，这种特异性结合可用于通过流式细胞术检测抗原特异性T细胞。然而，单价pMHC与TCR之间的亲和力远低于抗原与抗体之间的亲和力。这种相对较弱的结合导致形成的pMHC单体和TCR复合物的半衰期短和快速解离。为了增强pMHC和TCR之间的亲和力，已经开发了各种pMHC多聚体，例如二聚体、四聚体、五聚体、八聚体和右旋聚体。由于结构和制备简单，1996年建立的基于pMHC四聚体的检测方法仍然是抗原特异性T细胞分析的金标准，为T细胞免疫治疗奠定了基础。
[0004]然而，pMHC四聚体技术仍然存在一些局限性。由于结合亲和力不足，pMHC四聚体在抗原特异性CD4
+
T细胞、低亲和力αβT细胞和稀有γδT细胞的检测中表现不尽如人意。pMHC四聚体的最大化合价仅限于四个MHC分子，但由于链霉亲和素作为支架，其分子的四重对称性，四聚体上只有三个pMHC可以同时与T细胞表面的TCR结合。提高多聚体上的pMHC数量是增强结合亲和力的有效方法。然而，除了显示在多聚体支架上的pMHC数量外，它们的空间排列和方向也是重要的参数。当pMHC单体面向统一方向时，pMHC多聚体的亲和力更高。因此，迫切需要一种能够实现四个以上pMHC单体精确空间和单向组装的多聚体支架，以有效检测抗原特异性T细胞。而DNA纳米技术为此提供了契机。
[0005]DNA纳米结构，作为展示分子的多功能平台具有巨大的潜力，引起了包括生物医学在内的许多研究领域极大的关注。DNA纳米结构由一条或多条模板链和许多短链组成，通过碱基互补配对自组装。DNA纳米结构的每一条短链都是独一无二的，这使得DNA纳米结构成为一种可编程的纳米结构。通过序列延伸和末端修饰，可以将DNA纳米结构的短链设计为捕获链，用于距离、数量和模式可控的蛋白质链接支架。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种基于DNA纳米技术的pMHC多聚体的精确空间组装方法，以及将其用于检测抗原特异性T细胞的方法。
[0007]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种基于DNA纳米技术的pMHC多聚体制备方法，包括以下步骤：
[0008]A、带有特定捕获链的矩形DNA纳米结构的制备：将1条模板链和若干条短链通过碱基互补配对自组装形成带有特定捕获链的矩形DNA纳米结构；
[0009]B、利用点击化学反应将叠氮化物修饰的SpyTag与含有DBCO修饰的互补链偶联链接，得到SpyTag
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互补链；
[0010]C、将SpyTag
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互补链、PE修饰的互补链与矩形DNA纳米结构上的捕获链通过退火发生碱基互补配对链接，得到带有SpyTag的DNA纳米结构；
[0011]其中，步骤B和C中所述的互补链与步骤A中所述的捕获链互补配对；
[0012]D、构建pMHC与SpyCatcher融合蛋白(在pMHC的C端融合SpyCatcher)，与带有SpyTag的DNA纳米结构混合，DNA纳米结构上的SpyTag与SpyCatcher通过异肽键从而将pMHC单体链接在DNA纳米结构表面。
[0013]优选地，所述模板链的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述短链共143条，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2
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144所示。
[0014]优选地，SpyTag的氨基酸序列为SLLFLLFSL。
[0015]优选地，所述互补链包括与链接PE的捕获链互补的互补链以及与链接pMHC的捕获链互补的互补链，与链接PE的捕获链互补的互补链的核苷酸序列为PE
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TTTTTTTAATTAATTTTTT，与链接pMHC的捕获链互补的互补链的核苷酸序列为N3
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TTTTTGGTAGTGTAGGACTCCTAGC。
[0016]优选地，所述捕获链包括链接PE的捕获链以及链接pMHC的捕获链。
[0017]链接PE的捕获链的核苷酸序列如SEQ ID NO:145所示；其中，SEQ ID NO:145所示捕获链替换DNA纳米结构中SEQ ID NO:24所示的短链。
[0018]链接3个pMHC的捕获链的核苷酸序列如SEQ ID NO:146
‑
148所示；其中，SEQ ID NO:146所示捕获链替换DNA纳米结构中SEQ ID NO:139所示的短链，SEQ ID NO:147所示捕获链替换DNA纳米结构中SEQ ID NO:80所示的短链，SEQ ID NO:148所示捕获链替换DNA纳米结构中SEQ ID NO:97所示的短链。
[0019]链接6个pMHC的捕获链的核苷酸序列如SEQ ID NO:149
‑
154所示；其中，SEQ ID NO:149所示捕获链替换DNA纳米结构中SEQ ID NO:15所示的短链，SEQ ID NO:150所示捕获链替换DNA纳米结构中SEQ ID NO:139所示的短链，SEQ ID NO:151所示捕获链替换DNA纳米结构中SEQ ID NO:101所示的短链，SEQ ID NO:152所示捕获链替换DNA纳米结构中SEQ ID NO:80所示的短链，SEQ ID NO:153所示捕获链替换DNA纳米结构中SEQ ID NO:142所示的短链，SEQ ID NO:154所示捕获链替换DNA纳米结构中SEQ ID NO:97所示的短链。
[0020]链接9个pMHC的捕获链的核苷酸序列如SEQ ID NO:155
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163所示；其中，SEQ ID NO:155所示捕获链替换DNA纳米结构中SEQ ID NO:15所示的短链，SEQ ID NO:156所示捕获链替换DNA纳米结构中SEQ ID NO:10所示的短链，SEQ ID NO:157所示捕获链替换DNA纳米结构中SEQ ID NO:139所示的短链，SEQ ID NO:158所示捕获链替换DNA纳米结构中SEQ ID NO:101所示的短链，SEQ ID NO:159所示捕获链替换DNA纳米结构中SEQ ID NO:66所示的短链，SEQ ID NO:160所示捕获链替换DNA纳米结构中SEQ ID NO:80所示的短链，SEQ ID NO:161本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于DNA纳米技术的pMHC多聚体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A、带有特定捕获链的矩形DNA纳米结构的制备：将1条模板链和若干条短链通过碱基互补配对自组装形成带有特定捕获链的矩形DNA纳米结构；B、利用点击化学反应将叠氮化物修饰的SpyTag与含有DBCO修饰的互补链偶联链接，得到SpyTag
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互补链；C、将SpyTag
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互补链、PE修饰的互补链与矩形DNA纳米结构上的捕获链通过退火发生碱基互补配对链接，得到带有SpyTag的DNA纳米结构；其中，步骤B和C中所述的互补链与步骤A中所述的捕获链互补配对；D、构建pMHC与SpyCatcher融合蛋白(在pMHC的C端融合SpyCatcher)，与带有SpyTag的DNA纳米结构混合，DNA纳米结构上的SpyTag与SpyCatcher通过异肽键从而将pMHC单体链接在DNA纳米结构表面。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述模板链的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述短链共143条，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2
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144所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，SpyTag的氨基酸序列为SLLFLLFSL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获链包括链接PE的捕获链以及链接pMHC的捕获链；链接PE的捕获链的核苷酸序列如SEQ ID NO:145所示；链接3个pMHC的捕获链的核苷酸序列如SEQ ID NO:146
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148所示；链接6个pM...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵潇，马娜娜，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，
类型：发明
国别省市：