微卫星不稳定性测量制造技术

描述了用于检测生物样本中的微卫星不稳定性的系统和方法。从毛细管电泳基因分析仪器接收信号数据，其中信号数据是从包括通过聚合酶链式反应(PCR)从生物样本扩增的核酸序列的片段的荧光测量的。核酸序列对应于多个不同的微卫星位点，并且使用多个PCR引物获得，所述PCR引物被配置为位于生物样本的多个微卫星位点的两侧。当PCR引物和生物样本结合并进行PCR扩增时，产生包括多个微卫星位点的荧光标记的DNA片段。使用从多个荧光标记的微卫星位点获得的荧光数据对生物样本的微卫星不稳定性进行分类。行分类。行分类。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】微卫星不稳定性测量
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年11月8日提交的美国临时申请62/932,987；2019年11月8日提交的美国临时申请62/932,910；以及2019年11月8日提交的美国临时申请62/932,752的优先权权益。本文所讨论的这些和所有其他外在材料以全文引用的方式并入。

技术介绍

[0003]本公开一般涉及DNA片段分析。
[0004]癌症的一个致病因素被认为是修复DNA的生物分子机制的破坏。在细胞复制过程中，DNA修复机制对复制细胞的完整性至关重要。当这些机制破坏时，错误会在由此产生的细胞携带的DNA中积累。有一些抗癌药物可以利用这种破坏来识别和破坏肿瘤。当肿瘤表现出高突变率时，这些药物最有效，而突变率又与DNA修复生物分子机制的高度故障相关联。检测药物最有效的情况的一种方法是检查DNA由许多重复子序列组成的位点处DNA偏离正常的程度。这些子序列被称为微卫星。
[0005]微卫星标记(位点)，也称为短串联重复序列(STR)，是由重复的核苷酸序列组成的多态性DNA位点。在典型的微卫星分析中，微卫星位点通过聚合酶链式反应(PCR)使用荧光标记的正向引物和未标记的反向引物进行扩增。PCR扩增子使用电泳按大小分离。应用包括链接映射；动物养殖；人类、动物和植物分型；病原体亚种
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分型；基因多样性；微卫星不稳定性；杂合性丧失(LOH)；简单序列间重复(ISSR)；多位点变异分析(MLVA)；和癌症治疗的伴随诊断。
[0006]当给定DNA位点的微卫星数量与正常值有很大差异时，所述微卫星位点被认为是微卫星不稳定的(MSU)。当众多微卫星位点表现出不稳定性时，DNA样本被认为具有高微卫星不稳定性，MSI高。当只有少数表现出不稳定性时，DNA样本被认为是MSI低。当没有一个表现出不稳定性时，DNA样本被认为是微卫星稳定的，MSS。
[0007]在给定的微卫星位点，毛细管电泳(CE)可用于通过使用片段分析来测量微卫星的数量。与琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳等其他方法相比，自动化CE使用荧光染料并以更高的分辨率和准确度进行分离。
[0008]为了在CE系统上运行片段分析，可以将探针和引物设计为位于感兴趣区域的两侧。这可以通过将荧光染料附着到与聚合酶链式反应(PCR)一起使用的引物或探针上来完成，以在电泳前扩增感兴趣的DNA位点并将扩增子提交给CE。还存在大小确定标准，即一组已知大小的碎片，其标记的颜色与测试碎片的颜色不同。然后将标记的PCR产物和大小确定标准以电动方式注入毛细管。在电泳过程中，当在电极之间施加高压时，带负电的DNA片段从阴极移动，通过填充聚合物的毛细管向带正电的阳极移动。
[0009]使用CE进行的DNA片段分析可以进行多重分析，这意味着反应孔中有多个片段通过同一毛细管。较小的片段通常运行得较快，而较大的片段运行得较慢。在快要到达正极时，按大小分离的荧光标记的DNA片段移动通过激光束的路径。激光束使碎片上的染料以不同的发射波长发出荧光。CCD相机检测荧光，并且荧光强度被数字化、颜色编码并在电泳图
中显示为峰值。相对于较短的片段，较长的片段将出现在数据的后面。

技术实现思路

[0010]当具有与正常分子不同的微卫星的DNA比例较低时，可能很难检测到异常DNA分子的存在。需要更准确的方法来分析CE数据以解决足够的不确定性，以可靠地区分在给定DNA位点处的高MSI与稳定的MSI，并确定总体基因图谱是否可以被认为是MSI高或MSI低。
[0011]使用CE片段分析有可能的替代方法。在简单的实例中，测序技术可用于对感兴趣的DNA位点进行测序，并通过序列分析(例如，计算序列中微卫星的数量)分配MSI状态。然而，使用除CE片段分析之外的测序技术或类似方法可能是不利的。例如，DNA序列分析对多路数据的能力有限。此外，DNA序列分析过程耗时较长，分析可能更容易出错。
[0012]涉及手动检查CE片段分析数据以进行MSI状态调用的现有技术解决方案往往相当耗时并且对有限的手动检查时间的使用效率低下。本文所讨论的本专利技术实施方案提供了在许多情况下自动进行MSI状态调用的合理方法的非常广泛的覆盖范围。所描述的方法还可用于为调用分配置信度度量，例如，通过报告计算结果与决策阈值的接近程度，这反过来可用于将人工审查工作集中在自动MSI评估信心不足的那些情况。
[0013]公开了用于检测生物样本中的微卫星不稳定性的本专利技术的实施方案。从毛细管电泳基因分析仪器接收信号数据，其中信号数据是从包括通过聚合酶链式反应从生物样本扩增的核酸序列的片段的荧光测量的。核酸序列对应于多个不同的微卫星位点。不同的位点可以表现出不同的信号特征。在特定位点，可以应用具有层次结构的分析方法，这也可能是所述位点处信号数据的特征所特有的。例如，可以如下描述三级层次结构：实施第一处理算法以基于信号数据获得关于多个不同微卫星位点中的一个或多个第一微卫星位点的不稳定性的第一确定。实施第二处理算法以基于信号数据获得关于多个不同微卫星位点中的一个或多个第二微卫星位点的不稳定性的第二确定。然后实施第三处理算法以至少基于第一确定和第二确定来测量生物样本的微卫星不稳定性。
[0014]本专利技术的实施方案描述了分析CE数据以确定给定DNA位点是否异常并确定总体基因图谱(结合来自所有位点的结果)是否可以被认为是MSI高、MSI低或MSS的方法的集合。本文所述的方法提供了一种自动进行调用的方法。所描述的方法还可用于为调用分配置信度度量，例如，通过报告计算结果与决策阈值的接近程度，这反过来可用于将人工审查工作集中在自动MSI评估信心不足的那些情况。
[0015]本文公开的本专利技术的实施方案描述了一种异构分析方法，范围从简单阈值到利用深度学习技术。其原因是，将总体基因图谱分配给MSI高、MSI低或MSI稳定可能涉及DNA中的一个微卫星位点到DNA中的许多微卫星位点。分析算法的复杂性取决于所选位点的DNA复制模式的性质。可以为不同的癌症选择不同的位点，因为与其他癌症类型相比，某些位点可能对给定的癌症类型更敏感，和/或与其他位点组合，可能会产生对MSI状态更敏感和/或特定的测试，和/或者DNA可能被更可靠地扩增。
附图说明
[0016]图1图示了根据本专利技术实施方案的系统；
[0017]图2图示了在本专利技术的一些实施方案中使用的示例性毛细管电泳过程；
[0018]图3图示了在本专利技术的一些实施方案中使用的示例性基因分析仪；
[0019]图4图示了用于图3的示例性基因分析仪的示例性一体式卡盒；
[0020]图5图示了在本专利技术的一些实施方案中使用的用户界面显示的四个示例性屏幕截图；
[0021]图6图示了描绘图3的示例性基因分析仪的云集成过程的流程图；
[0022]图7图示了根据本专利技术的一些实施方案的方法的流程图；
[0023]图8图示了根据本专利技术的一些实施方案的替代方法的流程图；
[0024]图9图示了可以实现本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种识别生物样本中微卫星不稳定性的方法，包括：通过检测包括使用所述生物样本获得的核酸序列的片段的荧光来获得多个信号，其中每个信号对应于多个不同的微卫星位点之一；为所述多个信号中的每一个确定一个或多个信号特征；和将一个或多个分类器应用于所述多个微卫星位点的一个或多个信号特征以识别所述生物样本是微卫星不稳定性高、微卫星不稳定性低还是微卫星稳定。2.根据权利要求1所述的方法，还包括将一个或多个分类器应用于与所述多个不同微卫星位点中的每个单独微卫星位点的所述信号相对应的一个或多个信号特征，以识别每个单独微卫星位点是微卫星不稳定还是微卫星稳定，并组合这些跨位点的确定以确定所述生物样本的微卫星状态。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述应用一个或多个分类器包括比较源自所述物样本的信号特征和源自一个或多个非癌组织样本的信号特征。4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中至少一个分类器包括片段大小阈值。5.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中至少一个分类器包括片段大小区间。6.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中应用所述一个或多个分类器包括评估指定大小区间内的峰值计数。7.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中应用所述一个或多个分类器包括评估指定大小区间内肿瘤与正常组织之间的相对峰值计数。8.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中应用所述一个或多个分类器包括评估指定大小区间内的峰值包络计数。9.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中应用所述一个或多个分类器包括评估指定大小区间内的峰值包络分离。10.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中应用所述一个或多个分类器包括评估指定大小区间内的峰值包络分离。11.根据权利要求1或2所述的方法，其中应用所述一个或多个分类器包括评估一个或多个峰值位置在指定大小区间内的偏移。12.根据权利要求1或2所述的方法，其中应用所述一个或多个分类器包括分析峰值模式输入。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述峰值模式输入包括以下两个或多个值：沿所述片段大小轴的峰值幅度、沿所述片段大小轴的峰值位置；相对于最大峰值的峰值幅度、相对于最大峰值的峰值位置、峰值包络峰值幅度、峰值包络峰值位置、峰值包络峰值宽度或相对于峰值包络度量的峰值度量。14.根据权利要求2所述的方法，还包括：当微卫星位点的百分比被确定为微卫星不稳定高于第一预定阈值时向所述生物样本分配高微卫星不稳定性状态，如果微卫星位点的所述百分比被确定为微卫星不稳定高于第二预定阈值但低于所述第一确定阈值，那么分配低微卫星不稳定性状态，或者如果被确定为微卫星不稳定的微卫星位点的所述百分比低于所述第二预定阈值，那么分配微卫星稳定状态。15.根据权利要求2所述的方法，还包括：
分析所述信号特征以将稳定值或不稳定值分配给每个所述微卫星位点；跨所述微卫星位点的所述分配稳定和不稳定值计算加权和；和如果跨所述微卫星位点的所述加权和超过第一预定阈值，那么向所述生物样本分配高微卫星不稳定性状态，如果跨微卫星位点的所述加权和超过第二预定阈值但未超过所述第一预定阈值，那么向所述生物样本分配低微卫星不稳定性状态阈值，或者如果跨所述微卫星位点的所述加权和小于所述第二预定阈值，那么分配微卫星稳定状态。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述加权和是使用一个或多个分类函数来计算的，所述分类函数将所述多个信号特征映射到三个不同的输出值。17.一种用于识别生物样本中微卫星不稳定性的方法，包括：通过检测包括从所述生物样本中扩增的核酸序列的片段的荧光来获得多个信号，所述核酸序列对应于多个不同的微卫星位点，其中每个信号对应于多个不同的微卫星位点之一；和使用一个或多个分类器分析所述多个信号以识别所述生物样本是否具有高微卫星不稳定性、低微卫星不稳定性或微卫星稳定。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述分类器包括非线性分类函数。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述非线性分类函数包括多层人工神经网络。20.根据权利要求17所述的方法，其中所述分类器包括深度学习神经网络。21.一种包括存储在非暂时性计算机可读介质中的可执行代码的计算机程序产品，所述可执行代码可在一个或多个计算机处理器上执行以识别生物样本中的微卫星不稳定性，所述可执行代码包括一个或多个计算机可读指令，用于：从毛细管电泳基因分析仪器获得多个信号，其中所述信号是从包括通过聚合酶链式反应从所述生物样本扩增的核酸序列的片段的荧光检测的，所述核酸序列对应于多个不同的微卫星位点，其中每个信号对应于多个不同的微卫星位点之一；和使用一个或多个分类器分析所述多个信号中的每一个，以识别所述生物样本是否具有微卫星不稳定性高、微卫星不稳定性低或微卫星稳定状态。22.根据权利要求21所述的计算机程序产品，其中至少一个分类器包括人工智能生成的分类器。23.一种用于使用毛细管电泳基因分析仪来识别生物样本中微卫星不稳定性的系统，包括：一个或多个计算机处理器，所述一个或多个计算机处理器连接到存储一...

【专利技术属性】
技术研发人员：H，
申请(专利权)人：生命科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：