一种表达靶向CD47抑制因子的多能干细胞及其衍生物与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种表达靶向CD47抑制因子的多能干细胞及其衍生物与应用。该多能干细胞或其衍生物的基因组中导入CD47抑制因子的表达序列，所述CD47抑制因子为靶向CD47的shRNA和/或shRNA

【技术实现步骤摘要】
一种表达靶向CD47抑制因子的多能干细胞及其衍生物与应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种表达靶向CD47抑制因子的多能干细胞及其衍生物与应用。

技术介绍

[0002]CD47(即整合素相关蛋白，IAP)，是一种广泛表达于细胞表面的跨膜糖蛋白，该蛋白属于免疫球蛋白超家族。CD47的分子量在47
‑
55kD之间，包含1个胞外类Ig可变结构域、5个高度疏水延伸的跨膜片段以及1个段选折性拼接的羧基端胞质尾区。CD47是一种多能分子，其主要功能包括：
[0003](1)CD47与CD47配体信号调节蛋白α(signal
‑
regulatory protein，SIRPα)结合并与整合蛋白相互作用，调节细胞间通讯。CD47与巨噬细胞表面的SIRPα结合，激活酪氨酸磷酸化酶，抑制肌球蛋白在巨噬细胞突触膜下装配位点的聚集。因此，如果缺失CD47，则会导致老龄或受损细胞被吞噬。
[0004](2)CD47与凝血酶反应蛋白
‑
1结合，参与细胞与胞外机制的相互作用。
[0005](3)CD47与细胞的凋亡、增殖、黏附、迁移等细胞学过程密切相关，在免疫及心血管反应中扮演关键角色，是心血管疾病治疗的重要靶标。
[0006](4)CD47与肿瘤免疫逃逸相关，对肿瘤细胞的微环境有重要影响。
[0007]CD47目前已被发现在多种肿瘤类型中异常表达，包括急性骨髓白血病(AML)、慢性骨髓白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍金性淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌和其他实体瘤。因此，在天然免疫细胞如树突细胞等向适应性免疫T细胞提呈抗原的过程中，CD47也发挥着抑制作用。近些年来，CD47在肿瘤免疫治疗中逐渐升温，是肿瘤免疫治疗的一个潜在有效和广泛应用的靶点，因此许多抑制剂已经被开发出来，可以特异性地阻断CD47
‑
SIRPα信号通路，以增强对肿瘤的免疫应答。
[0008]另一方面，在细胞治疗领域，同种异体的免疫兼容问题依然是一大难题。近年已有许多报道通过敲除B2M、CIITA等基因，实现HLA
‑
I和HLA
‑
II细胞表面或本身基因的缺失表达，进而使细胞具备免疫耐受或逃逸T/B细胞特异性免疫应答，产生免疫兼容的通用型PSCs，为更广泛的通用型PSCs源细胞、组织、器官应用奠定了重要的基础。也有报道细胞过表达CTLA4
‑
Ig、PD
‑
L1从而抑制同种异的免疫排斥。然而，这些方案要么免疫兼容不彻底，仍有通过其他途径发生同种异体的免疫排斥；要么彻底消除同种异体免疫排斥应答，但使供体源移植物的细胞本身同时丧失了抗原提呈的能力，这给受体带来了极大的致瘤性和病毒感染等疾病的风险。
[0009]为此，也有报道，不直接敲除B2M，而敲除HLA
‑
A、HLA
‑
B或一并敲除CIITA的同时，保留HLA
‑
C，并构建12个覆盖人群超过90％的HLA
‑
C免疫配型抗原，以此达到移植物的细胞仍具备一定程度的抗原提呈功能，并且同时能够通过HLA
‑
C抑制NK细胞的固有免疫应答。但这类细胞，一来，HLA
‑
I类抗原提呈的抗原类型缩小了三分之二以上，能够提呈的抗原完整性极大地不可逆的缩小，对于各种肿瘤、病毒以及其他疾病抗原的提呈具有极大的偏向性，仍
然保留了相当程度的致瘤和病毒感染等疾病的风险，在CIITA同时敲除的情况下其致病风险更高；二来，12种高频率免疫配型的HLA
‑
C抗原种族差异很大，通过我们核实计算部分地区仅能占到70％的比例，而中国、印度等人口大国目前尚未有权威的大样本量的HLA数据展示，这样制备出来的通用型PSCs使用仍受到巨大的配型空缺考验；第三，这种方法会经历数次反复的基因编辑工作，按每次基因编辑至少两轮单细胞分离培养计，整个过程至少需要六轮以上的单细胞分离培养，这些流程不可避免且极大概率地因多次基因编辑脱靶或染色质不稳定或因大量单细胞传代增殖造成细胞各种不可预测的突变，进而诱发致癌、代谢疾病等各种问题。由此可见，这类免疫兼容方案亦为“过渡时期”的权宜之计，仍有许多问题没有更好的解决。
[0010]此外，还有人设计通过诱导自杀基因在供体组织、细胞致病后诱导杀死，这样做的后果将产生严重的组织坏死、细胞因子风暴等不可预知的疾病风险问题，并且这类设计的细胞杀死后将不复存在合适的供体细胞、组织和器官又是一大难题。

技术实现思路

[0011]本专利技术的目的在于提供一种多能干细胞或其衍生物。
[0012]本专利技术的另一目的在于提供上述多能干细胞或其衍生物及其分泌的外泌体在制备抗肿瘤治疗制剂或药物中的应用。
[0013]本专利技术的另一目的在于提供一种外泌体。
[0014]本专利技术所采取的技术方案是：
[0015]本专利技术的第一个方面，提供：
[0016]一种多能干细胞或其衍生物，该多能干细胞或其衍生物的基因组导入有CD47抑制因子的表达序列；所述CD47抑制因子为靶向CD47的shRNA和/或shRNA
‑
miR中的至少一种。
[0017]专利技术人发现，在多能干细胞或其衍生物中导入CD47抑制因子的shRNA/shRNA
‑
miR表达序列后，多能干细胞或其衍生物中分泌的外泌体中包含高丰度的靶向CD47的CD47抑制因子的shRNA/shmiRNA以及加工成熟的siRNA，外泌体携带这些抑制因子与靶细胞结合，然后将其释放，从而阻断CD47通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复NK细胞活性，其能够有效清除肿瘤细胞。
[0018]进一步地，所述靶向CD47的shRNA和/或shRNA
‑
miR的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示。
[0019]本专利技术的第二个方面，提供：
[0020]一种多能干细胞或其衍生物，该多能干细胞或其衍生物的基因组导入有CD47抑制因子的表达序列；所述CD47抑制因子为靶向CD47的shRNA和/或shRNA
‑
miR中的至少一种。
[0021]所述多能干细胞或其衍生物基因组的B2M基因和/或CIITA基因被敲除。
[0022]当B2M和CIITA基因被敲除后，其完全消除HLA
‑
I和HLA
‑
II类分子产生的影响，因此，其肿瘤治疗效果最佳。
[0023]本专利技术的第三个方面，提供：
[0024]一种多能干细胞或其衍生物，该多能干细胞或其衍生物的基因组导入有CD47抑制因子的表达序列；所述CD47抑制因子为靶向CD47的shRNA和/或shRNA
‑
miR中的至少一种。
[0025]上述多能干细胞或其衍生物的基因组中导入有第一核酸分子；且，上述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有CD47抑制因子的表达序列；所述CD47抑制因子为靶向CD47的shRNA和/或shRNA
‑
miR中的至少一种。2.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述靶向CD47的shRNA和/或shRNA
‑
miR的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述多能干细胞或其衍生物基因组的B2M基因和/或CIITA基因被敲除。4.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入有第一核酸分子；且，所述多能干细胞或其衍生物中的免疫应答相关基因的3
’
UTR区域还导入有第二核酸分子；所述第一核酸分子编码介导RNA干扰的小核酸分子，所述小核酸分子特异性靶向第二核酸分子的转录产物，且所述小核酸分子不靶向所述多能干细胞或其衍生物的任何其他的mRNA或lncRNA。5.根据权利要求4所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述小核酸分子包括短干扰核酸、短干扰RNA、双链RNA，优选为miRNA、shRNA、shRNA
‑
miR中的至少一种。6.根据权利5所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述多能干细胞或其衍生物来源于人类；所述小核酸分子的序列为不靶向人类任何mRNA或lncRNA的非人类物种的随机序列。7.根据权利要求4所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述第二核酸分子包括至少3个重复的小核酸分子序列的反向互补序列，优选为6～10个重复的小核酸分子序列的反向互补序列。8.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入至少一种免疫兼容分子的表达序列，所述免疫兼容分子用于调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达。9.根据权利要求4或8所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述与免疫应答相关的基因包括：(1)主要组织相容性复合体基因，包括HLA
‑
A、HLA
‑
B、HLA
‑
C、HLA
‑
DRA、HLA
‑
DRB1、HLA
‑
DRB3、HLA
‑
DRB4、HLA
‑
DRB5、HLA
‑
DQA1、HLA
‑
DQB1、HLA
‑
DPA1和HLA
‑
DPB1中的至少一种；(2)主要组织相容性复合体相关基因，包括B2M和CIITA中的至少一种。10.根据权利要求8所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述免疫兼容分子包括以下的至少一种：(1)免疫耐受相关基因，包括HLA
‑
G；(2)HLA
‑
C类分子，包括人群中比例合计超过90％的HLA
‑
C复等位基因，或者超过90％的HLA
‑
C复等位基因与B2M构成的融合蛋白基因；(3)靶向主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA
‑
miR，所述主要组织相容性复合体基因包括HLA
‑
A、HLA
‑
B、HLA
‑
C、HLA
‑
DRA、HLA
‑
DRB1、HLA
‑
DRB3、HLA
‑
DRB4、HLA
‑
DRB5、HLA
‑
DQA1、HLA
‑
DQB1、HLA
‑
DPA1和HLA
‑
DPB1中的至少一种；(4)靶向主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA
‑
miR，所述主要组织相容
性复合体相关基因包括B2M和CIITA中的至少一种。11.根据权利要求10所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：靶向B2M的shRNA和/或shRNA
‑
miR的靶序列选自SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.12中的一种；靶向CIITA的shRNA和/或shRNA
‑
miR的靶序列选自SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.15中的一种；靶向HLA
‑
A的shRNA和/或shRNA
‑
miR的靶序列选自SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.18中的一种；靶向HLA
‑
B的shRNA和/或shRNA
‑
miR的靶序列选自SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.21中的一种；靶向HLA
‑
C的shRNA和/或shRNA
‑
miR的靶序列选自SEQ ID NO.22～SEQ ID NO.24中的一种；靶向HLA
‑
DRA的shRNA和/或shRNA
‑
miR的靶序列选自SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.27中的一种；靶向HLA
‑
DRB1的shRNA和/或shRNA
‑
miR的靶序列选自SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30中的一种；靶向HLA
‑
DRB3的shRNA和/或shRNA
‑
miR的靶序列选自SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.32中的一种；靶向HLA
‑
DRB4的shRNA和/...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淋立，陈月花，莫健，杨建国，
申请(专利权)人：王淋立，
类型：发明
国别省市：