ZmWRKY70蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用制造技术

本发明专利技术公开了ZmWRKY70蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用。本发明专利技术提供的DNA分子，为WRKY70基因，是如下：(b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；(b2)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；本发明专利技术提供的WRKY70基因经CRISPR

【技术实现步骤摘要】
ZmWRKY70蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种ZmWRKY70蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用。

技术介绍

[0002]玉米是世界三大粮食作物之一，种植区域广泛，但在各地区的分布并不均匀，不同的地区，环境不同，气候条件不同，降水量不同，其中，干旱是影响玉米产量的重要因素，在玉米苗期干旱会抑制玉米生长速率，导致发育期严重缩短，干旱还会抑制玉米株高，导致叶片萎蔫，从而使光合作用减少，在玉米灌浆期干旱会导致籽粒不饱满，从而导致玉米产量减少。我国一半以上玉米种植在西北、西南、华北和东北地区依靠自然降水的旱地上，这些地方年降水量200
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600mm不等，有些地方蒸发量大，水分流失快,水分对于玉米的生长发育满足率很低，严重影响玉米的生长。因此提高玉米的抗旱性对于玉米产量至关重要。
[0003]植物中存在大量的转录因子，转录因子通过与靶基因特定序列结合调控其表达，在整合外界环境信号、调节植物生长发育中发挥重要作用，但转录因子在植物响应生物和非生物胁迫，如干旱、抗冷中的具体机制仍待进一步探究。作为植物所特有的最大的转录因子家族之一，WRKY转录因子是植物生存过程中不可或缺的关键调控子，在不同的生理过程中发挥正调控或负调控作用。目前已经在多个物种中鉴定获得WRKY家族基因,拟南芥中有74个WRKY基因,水稻中超过100个,大豆中有197个,玉米B73自交系中有119个。WRKY转录因子是一类DNA结合蛋白，包含N端高度保守的WRKY蛋白结构域，由60个氨基酸组成，能够结合DNA，具有WRKYGQK基序以及C端Zn
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finger基序。除此之外，大多数WRKY转录因子还具有核定位信号(NLS)、激酶结构域等其它结构。WRKY转录因子通常在转录激活/抑制结构域富集，激活/抑制目的基因的转录。已有研究表明，WRKY转录因子的表达受水杨酸(SA)等防御信号分子快速诱导，在植物防御病原体攻击、调节植物生长发育及代谢、衰老等多个生理过程中发挥重要作用。
[0004]玉米的产量容易受到干旱胁迫影响，通过基因工程方法改良玉米抗旱性，对保护玉米产量具有重要意义。B73玉米基因组测序已经完成，基因编辑和遗传转化技术也在不断更新，为通过基因工程手段改良玉米抗旱性提供了重要保障。

技术实现思路

[0005]本专利技术一个目的是提供一种DNA分子。
[0006]本专利技术提供的DNA分子，为WRKY70基因，是如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)的DNA分子：
[0007](b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；
[0008](b2)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；
[0009](b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0010](b4)来源于玉米且与(b1)或(b2)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
[0011]上述DNA分子编码的蛋白质也是本专利技术保护的范围。
[0012]上述蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：
[0013](a1)序列表中序列2所示的蛋白质；
[0014](a2)将序列表中序列2所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱性相关的由其衍生的蛋白质；
[0015](a3)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
[0016](a4)来源于玉米且与(a1)具有98％以上同一性且与植物抗旱性相关的蛋白质。
[0017]标签具体如表1所示。
[0018]表1为标签的序列
[0019]标签残基序列Poly
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Arg5
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6(通常为5个)RRRRRPoly
‑
His2
‑
10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep
‑
tag II8WSHPQFEKc
‑
myc10EQKLISEEDLHA9YPYDVPDYA
[0020]上述玉米WRKY70基因由5524个碱基(序列1)组成，T01转录本的读码框为序列3，编码的蛋白为序列2，命名为WRKY70蛋白。该基因由3个外显子组成，读码框第584位到第2136位碱基，第2755位到第2895位碱基，第3978位到第4924位碱基，其余为其内含子序列。基因来源于B73型玉米，由于玉米同一DNA段序列可产生不同转录本，翻译出不同蛋白质，该DNA段序列产生的不同转录本以及翻译出的不同具有抗旱功能的蛋白质均在本专利技术保护范围内。
[0021]含有上述DNA分子的重组载体、表达盒或重组菌也是本专利技术保护的范围。
[0022]上述DNA分子或上述的蛋白质在调控植物抗旱型中的应用也是本专利技术保护的范围。
[0023]降低上述蛋白质活性或含量的物质在降低植物抗旱性或培育对干旱敏感植物中的应用也是本专利技术保护的范围。
[0024]或，抑制上述DNA分子表达的物质在降低植物抗旱性或培育对干旱敏感植物中的应用也是本专利技术保护的范围。
[0025]上述应用中，所述物质为CRISPR/Cas9系统；
[0026]所述CRISPR/Cas9系统包括如下1)或2)：
[0027]1)sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1和/或sgRNA2；
[0028]所述sgRNA1的靶点为序列1第1580
‑
1598位；
[0029]所述sgRNA2的靶点为序列1第1633
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1651位；
[0030]2)表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。
[0031]WRKY70基因的核苷酸序列如序列1所示，根据本专利技术公开的核苷酸序列，通过
CRISPR/Cas9基因编辑技术，取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸，得到影响WRKY70蛋白功能的突变序列。具体地说，本专利技术的技术方案包括：利用网站设计WRKY70基因的编辑靶点，根据靶点设计引物，通过PCR、酶切、连接等一系列过程，构建CRISPR/Cas9的载体，将载体转入农杆菌，用农杆菌侵染玉米幼胚的方式得到转化苗，用除草剂和PCR鉴定筛选阳性植株，提取突变体植株DNA进行测序，获得具有突变位点的突变体。突变体经自交繁种后进行旱处理实验。WRKY70基因可进行编辑的靶点不止一个，经过编辑后的突变基因可能会产生一个或多个核苷酸增加或缺失，导致蛋白部分缺失或提前终止，其中有些突变会影响蛋白质的生物学功能。表达无功能蛋白的突变体植株可能会产生响应干旱胁迫的表型，均属于本专利技术要求保护的范围。获得突变体后，检测WRKY70突变体在干旱处理下的表型。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA分子，是如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)的DNA分子：(b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；(b2)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；(b4)来源于玉米且与(b1)或(b2)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。2.权利要求1所述DNA分子编码的蛋白质。3.根据权利要求2所述的蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：(a1)序列表中序列2所示的蛋白质；(a2)将序列表中序列2所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱性相关的由其衍生的蛋白质；(a3)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；(a4)来源于玉米且与(a1)具有98％以上同一性且与植物抗旱性相关的蛋白质。4.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒或重组菌。5.权利要求1所述DNA分子或权利要求2或3所述的蛋白质在调控植物抗旱型中的应用。6.降低权利要求2或3所述蛋白质活性或含量的物质在降低植物抗旱性或培育对干旱敏感植物中的应用；或，抑制权利要求1所述DNA分子表达的物质在降低植物抗旱性或培育对干旱敏感植物中的应用。7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述物质为CRISPR/Cas9系统；所述CRISPR/Ca...

【专利技术属性】
技术研发人员：巩志忠，王瑜，蒋杉，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：