一种固氮螺菌、其分离方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种固氮螺菌，其特征在于，其微生物学分类命名为固氮螺菌W712，拉丁文学名为Azospirillum sp.；其16S rDNA部分序列如序列表所示；其保藏编号为CGMCC No.1.18567。本发明专利技术还公开了所述固氮螺菌培养分离方法和其含氨基酸发酵提取物的制备方法和用途。本发明专利技术的固氮螺菌为新的菌株，用其制备得到的含氨基酸发酵提取物用于卷烟加香中，能增加烟气清甜感，丰富协调烟香的同时保持较好舒适性。丰富协调烟香的同时保持较好舒适性。丰富协调烟香的同时保持较好舒适性。

【技术实现步骤摘要】
一种固氮螺菌、其分离方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种固氮螺菌、其分离方法和其含氨基酸发酵提取物在烟草加香中的应用。

技术介绍

[0002]微生物发酵是在适宜的条件下，利用微生物将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。微生物发酵技术已在医药工业、食品工业、能源工业、化学工业、生态保护、农业等各个领域得到广泛应用。
[0003]卷烟加香是烟草行业一种常规的、必需的增补香气的技术手段，同时烟用香精香料的应用更是与卷烟品牌的树立及卷烟风格特征的彰显休戚相关。烟用香精香料来源广泛；其中利用微生物发酵技术制备烟用香料，由于其成本相对较低，不受气候、土地资源的限制，在缩短生产周期的同时，还可提高香料的产量和品质，属于对环境友好、资源节约型的产品技术研发，符合企业绿色、环保、安全、节约减排的发展要求，是烟用香料开发的一个重要方向。但目前能用于制备烟用香料的微生物优势菌株仍然较少，所开发香料的香型和功效作用较为单调；所以对微生物开展持续筛选及开发利用、拓展微生物在香精香料领域的功能应用，以满足烟用香精香料研发和生产需求，具有现实的必要性。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种新的固氮螺菌、其培养分离和鉴别方法；本专利技术的目的还在于提供所述固氮螺菌含氨基酸发酵提取物，作为生物香料在卷烟加香中的应用。
[0005]本专利技术通过以下技术方案实现上述目的。
[0006]除非另有说明，本专利技术中所采用的百分数均为质量百分数。
[0007]本专利技术第一方面公开了一种具有固氮功能的微生物固氮螺菌W712，其是从云南昆明烟草种植基地烟草根际土壤样品中分离得到的，对其进行了形态学、生理生化性质和16S rDNA分析，鉴定结果表明其属于固氮螺菌，其微生物学分类命名为固氮螺菌W712，拉丁文学名为Azospirillum sp.，已于2021年10月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No.1.18567，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。
[0008]本专利技术分离得到的固氮螺菌W712菌株的主要形态特征和生理生化性质特征为：在大多数培养基上生长良好，在R2A琼脂培养基上，菌落边缘整齐，中间凸起，呈淡粉红色。氧化酶、柠檬酸利用、硝酸盐还原、脲酶呈阳性，精氨酸双水解酶、明胶液化、色氨酸脱氨酶呈阴性。能利用果糖、半乳糖醛酸、甘油、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸。细胞膜的极性脂成分主要包括双磷脂酰甘油、磷脂酰甘油、磷脂酰甲基乙醇胺，磷脂酰胆碱及一个未知的含氨基的极性脂细胞的呼吸醌为泛醌
‑
10(Q
‑
10)。
[0009]本专利技术所分离得到的烟草固氮螺菌W712的16S rDNA基因核苷酸序列如序列表所示，该序列已递交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序列检索号：MT559271。
[0010]本专利技术第二方面公开了一种分离、培养和鉴别所述的固氮螺菌W712的方法，包括以下步骤：
[0011]a、从自然环境中取土壤样品，加无菌水，摇床振荡，制备成母液；
[0012]b、加无菌水将步骤a的母液进行梯度稀释，并分别接种于Ashby无氮固体培养基上进行筛选培养，挑选生长较好的菌落进行纯化，得到分离的微生物单菌落；
[0013]c、将步骤b得到的微生物单菌落接种到斜面培养基，保存备用，并对菌株进行形态学分析、生理生化测定，完成系统发育树构建，进行分子鉴别，得到所述的固氮螺菌。
[0014]优选地，步骤a中的土壤样品取自云南昆明烟草种植基地的烟草根际土壤。
[0015]优选地，步骤a中的摇床振荡温度为28℃，振荡速度为180rpm，振荡时间为30min。
[0016]优选地，步骤b中的Ashby无氮固体培养基组成如下：甘露醇、10g，琼脂、15g，NaCl、0.2g，CaCO3、5g，KH2PO4、0.2g，MgSO4·
7H2O、0.2g，CaSO4·
2H2O、0.1g，蒸馏水定容至1000ml，调节pH值为7.0～7.2。
[0017]优选地，步骤b的具体步骤为：将母液用无菌水稀释至10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5倍，分别取0.2mL均匀涂布于Ashby无氮固体平板培养中，置于恒温恒湿培养箱中，28℃培养4d，观察菌落形态，挑选生长较好的菌落进行划线纯化数次，至有规则单菌落出现，得到分离的微生物菌液。
[0018]优选地，步骤c将微生物单菌落接种到R2A斜面培养基，28℃培养2d，置于4℃冰箱保存备用。
[0019]本专利技术第三方面公开了所述固氮螺菌用于制备发酵生物香料的用途。
[0020]优选地，所述固氮螺菌制备发酵生物香料的步骤为：将固氮螺菌扩大培养后接种于发酵培养基中，28℃下摇瓶培养7天后，发酵悬浮液利用离心设备进行离心分离，上层滤液在50～60℃条件下浓缩得到固形物含量50％～80％的浓缩发酵液；浓缩发酵液用浓度30％～50％乙醇溶剂回溶，其中浓缩发酵液与溶剂体积比为V:V＝1:20～1:40；冷藏静置沉淀12～24h后进行过滤，滤液在50～60℃条件下浓缩得到固形物含量60％～80％的的黄棕色液体，为含氨基酸发酵提取物，即为所述发酵生物香料；该发酵提取物经分析含有多种氨基酸成分。
[0021]本专利技术第四方面公开了所述发酵生物香料用于烟草加香的用途。优选将得到的含氨基酸发酵提取物加入到卷烟烟丝中。能增加烟气清甜感，丰富协调烟香的同时保持较好舒适性。
[0022]本专利技术具有以下有益效果：
[0023]1、本专利技术首次从云南昆明烟草根际土壤样品中分离得到了新的菌种W712，经形态学、生理生化性质和16S rDNA分析，鉴定结果表明，该菌株是一种新的细菌，属于固氮螺菌，微生物学分类命名为固氮螺菌W712，拉丁文学名为Azospirillum sp.；保藏编号为CGMCC No.1.18567。
[0024]2、固氮菌是细菌中的一科，能直接利用大气中的分子态氮在固氨酶的作用下还原转化为氨，并进一步合成氨基酸，组成自身蛋白质，或为共生的农作物提供氮素养分，促进植物生长。利用无氮培养基对本专利技术得到的固氮螺菌W712进行筛选培养，验证了该菌具有良好的生物固氮能力，作为能提供氮素养分的优势菌种，可应用于农业生产与研究中。
[0025]3、本专利技术得到的固氮螺菌W712，其发酵提取物加入到卷烟烟丝中，能增加烟气清
甜感，丰富协调烟香的同时能保持较好舒适性。固氮螺菌W712发酵产物提取物适合卷烟加香，具有提升卷烟抽吸品质的效果。
附图说明
[0026]图1为本专利技术的固氮螺菌W712在R2A培养基上的电镜照片；
[0027]图2为本专利技术固氮螺菌W712及部分相关菌株依据16S rDNA基因序列构建的系统发育树。
具体实施方式
[0028]以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固氮螺菌，其特征在于，其微生物学分类命名为固氮螺菌W712，拉丁文学名为Azospirillum sp.；其16S rDNA部分序列如序列表所示；其保藏编号为CGMCC No.1.18567。2.一种分离根据权利要求1所述固氮螺菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：a、从自然环境中取土壤样品，加无菌水，摇床振荡，制备成母液；b、加无菌水将步骤a的母液进行梯度稀释，并分别接种于Ashby无氮固体培养基上进行筛选培养，挑选生长较好的菌落进行纯化，得到分离的微生物单菌落；c、将步骤b得到的微生物单菌落接种到斜面培养基，保存备用，并对菌株进行形态学分析、生理生化测定，完成系统发育树构建，进行分子鉴别，得到所述的固氮螺菌。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a中的土壤样品取自云南昆明烟草种植基地的烟草根际土壤。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a中的摇床振荡温度为28℃，振荡速度为180rpm，振荡时间为30min。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤b中的Ashby无氮固体培养基组成如下：甘露醇、10g，琼脂、15g，NaCl、0.2g，CaCO3、5g，KH2PO4、0.2g，MgSO4·
7H2O、0.2g，CaSO4·
2H2O、0.1g，蒸馏水定容至1000ml，调节pH值为7.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：段焰青，周兴奎，高莉，李源栋，杜刚，刘志华，顾健龙，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：