一种河豚毒素的非诊断目的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种河豚毒素的非诊断目的的检测方法，其用得到的氨基酸序列如SEQID NO:1、3、5、7、9或11所示模拟表位肽的噬菌体建立了灵敏、快速的竞争型酶联免疫分析法；该方法IC

【技术实现步骤摘要】
一种河豚毒素的非诊断目的检测方法


[0001]本专利技术涉及河豚毒素检测
，具体地，涉及一种河豚毒素的非诊断目的检测方法。

技术介绍

[0002]河豚毒素是一种毒性很强的非蛋白类神经毒素，该毒素作用于中枢及周围神经系统，选择性的与细胞膜表面的钠离子通道上的蛋白质结合，从而阻断钠离子通道，直接影响神经肌肉兴奋性的传导，使得神经肌肉呈麻痹状态，甚至引起死亡。河豚毒素不仅是一种毒性很强的海洋毒素，且其性质非常稳定，一般的烹饪手段难以破坏，这就造成了很多河豚毒素中毒的事件，使得河豚毒素的检测变得尤为重要。除此之外，河豚毒素在医学方面也有很重要的应用价值，它可以作为很好的镇痛和麻醉药物，还可以作为戒毒和抗心律失调的药物等。河豚毒素的检测对于毒素的提取和鉴定也有重要的意义。
[0003]目前河豚毒素的的检测方法主要是理化分析和免疫化学法，但这两种方法都有一定的局限性，其中一点就是必须要用到河豚毒素的标品来作为竞争性抗原、标准或竞争性示踪剂。目前国际上河豚毒素标准品的价格不菲，而且属于生物制剂遭到国际禁运，此外，河豚毒素本身就是一种剧毒，对于实验室以及实验室的操作人员本身就是一种安全隐患。因此，建立一种无毒的检测方法，能够很大程度上缓解毒素标品的稀少而带来的检测压力，同时可以降低实验室人员中毒的风险。
[0004]噬菌体展示技术可以将随机编码的目的基因插入丝状噬菌体基因III中，并与pIII蛋白融合展示，这样就形成了一个以噬菌体为载体的肽库。再利用蛋白质之间的特异性结合的作用，从肽库里面分离出能和某抗体结合的特定的噬菌体，为该抗体的模拟表位，即一种能够与抗体特异性结合并通过模拟抗原表位与被分析物竞争结合位点的短肽。无毒检测的方法就是利用从噬菌体肽库里面筛出来的模拟表位来代替毒素和抗体相互作用，从而提供一种环境友好、无毒的分析方法。该方法筛选方便省时省力，成本低廉，性质稳定，最重要的是可降低实验人员的暴露有毒环境的风险。在有毒有害物质的免疫检测领域，模拟表位代替抗原进行免疫分析具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种河豚毒素的非诊断目的检测方法。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种河豚毒素模拟表位肽。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供一种编码河豚毒素模拟表位肽的基因。
[0008]本专利技术的第三个目的是提供一种质粒。
[0009]本专利技术的第四个目的是提供一种重组微生物。
[0010]本专利技术的第五个目的是提供一种噬菌体
[0011]本专利技术的第六个目的是提供一种河豚毒素的非诊断目的检测方法。
[0012]本专利技术的第七个目的是提供所述的河豚毒素模拟表位肽、所述的基因、所述质粒、所述重组微生物、所述噬菌体中的一种或几种在建立河豚毒素的非诊断目的检测和/或河豚毒素的检测试剂盒中的应用。
[0013]本专利技术的第八个目的是提供一种河豚毒素的检测试剂盒。
[0014]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
[0015](1)将纯化的河豚毒素单克隆抗体包被在高吸附酶标板上，用3％牛血清白蛋白封闭酶标板，随后将随机环七肽噬菌体展示库加入酶标板中进行淘筛，按照结合
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洗脱
‑
扩增的淘选方案进行，通过3轮的富集淘筛。其中，三轮淘筛包被的抗体用量和用于竞争洗脱噬菌体的河豚毒素标品的用量依次减少；
[0016](2)经过3轮淘筛后，随机挑选40个噬菌体单克隆进行噬菌体ELISA的初步鉴定，对于得到的12个阳性克隆进行扩增，测序共发现6种序列。
[0017]本专利技术利用竞争型模式的淘筛可展示模拟表位肽的噬菌体克隆，展示模拟表位蛋白的噬菌体与待测物(河豚毒素)，竞争包被在酶标板上的单克隆抗体(该抗体可以特异性识别河豚毒素)。判定阳性噬菌体克隆的依据是，加有噬菌体和PBS的混合物的反应孔有吸光值，即与噬菌体与抗体结合；同时在对照孔中(加入的是噬菌体与PBS稀释的待测物的混合物)吸光值显著降低，即待测物可以把噬菌体从抗体的结合位点上竞争下来，此噬菌体即可展示模拟表位肽的噬菌体克隆。该噬菌体以M13噬菌体质粒为载体，编码外源模拟表位肽的基因插入到噬菌体编码的膜蛋白的gⅢ基因中，使外源蛋白可展示于噬菌体PⅢ壳蛋白的N端。
[0018]因此本专利技术要求保护以下内：
[0019]一种河豚毒素模拟表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1、3、5、7、9或11所示。
[0020]优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0021]一种编码河豚毒素模拟表位肽的基因，编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1、3、5、7、9或11所示的肽。
[0022]优选地，编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的肽。
[0023]优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2、4、6、8、10或12所示。
[0024]更优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0025]一种质粒，含有所述的基因，和/或表达所述的河豚毒素模拟表位肽。
[0026]一种重组微生物，含有所述的基因，和/或表达的河豚毒素模拟表位肽。
[0027]一种噬菌体，表面展示有的河豚毒素模拟表位肽。
[0028]优选地，所述菌体以M13噬菌体质粒为载体，所述基因插入到噬菌体编码的膜蛋白的gⅢ基因中。
[0029]一种河豚毒素的非诊断目的检测方法，以抗河豚毒素的抗体作为包被抗体，以所述的河豚毒素模拟表位肽、和/或所述的噬菌体作为竞争抗原进行酶联免疫检测。
[0030]优选地，所述检测方法为竞争型酶联免疫分析法。
[0031]优选地，所述以抗河豚毒素的抗体为以抗河豚毒素的单克隆抗体。
[0032]最优选地，包括以下步骤
[0033]1、将特异性识别河豚毒素的抗体包被于固相载体；
[0034]2、Phage ELISA：
[0035]表面展示有氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的表位肽的噬菌体克隆与待测样本或梯度稀释的河豚毒素标准品，一同加入包被抗体的固相载体，孵育，PBST清洗后加入HRP标记的抗M13噬菌体HRP二抗，再次用PBST清洗，孵育，加入TMB显色液，避光显色，10％(v/v)H2SO4终止反应。读取450nm处的吸光值。
[0036]3、结果判读
[0037]以各浓度河豚毒素标准品为横坐标，所对应的B为纵坐标(B为系列河豚毒素浓度孔的吸光值)，拟合出图线，从图线中得到针对河豚毒素的检测范围。在检测待测样本的时候，通过同样的反应得出吸光值的读数，根据读数结果可以在图线中找到对应的毒素浓度，即为待检测样品的毒素浓度。
[0038]所述的河豚毒素模拟表位肽、所述的基因、所述质粒、所述重组微生物、所述噬菌体中的一种或几种在建立河豚毒素的非诊断目的检测和/或河豚毒素的检测试剂盒中的应用，也属于本专利技术的保护范围。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种河豚毒素模拟表位肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1、3、5、7、9或11所示。2.一种编码河豚毒素模拟表位肽的基因，其特征在于，编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1、3、5、7、9或11所示的肽。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:2、4、6、8、10或12所示。4.一种质粒，其特征在于，含有权利要求2所述的基因，和/或表达权利要求1所述的河豚毒素模拟表位肽。5.一种重组微生物，其特征在于，含有权利要求2所述的基因，和/或表达权利要求1的河豚毒素模拟表位肽。6.一种噬菌体，其特征在于，表面展示有权利要求1的河豚毒素模拟表位肽。7.一种河豚毒素的非诊断目的检测方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐振林，李亚茹，罗林，韦柳娜，雷红涛，李向梅，沈玉栋，王弘，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：