一种耐冷木聚糖酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有耐冷特性的新型木聚糖酶及其编码基因和应用。本发明专利技术提供了属于糖苷水解酶第8家族的新型木聚糖酶基因，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1，所编码的木聚糖酶蛋白质氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。利用该基因构建的工程菌株获得的重组木聚糖酶以玉米芯木聚糖为底物，通过DNS还原糖活性测定的方法测定其比活力为5546.9U/mg。该木聚糖酶能够在低温条件表现出较高的底物亲和力和催化效率，低温下比活力为1521.1U/mg。利用基因生产的木聚糖酶可用于木聚糖转化和木聚寡糖的制备以及食品烘焙中提高面包的品质和延长面包的货架期。期。期。

【技术实现步骤摘要】
一种耐冷木聚糖酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用


[0001]本专利技术属于工业微生物领域，公开了一种耐冷木聚糖酶及其基因、含有该基因的工程菌及其在木聚糖转化、食品烘焙与饲料方面的应用。

技术介绍

[0002]木聚糖是自然界中除纤维素外第二丰富的可再生生物质多糖,并广泛存在于硬木(15％
‑
30％)、软木(7％
‑
10％)和草本类植物中(低于30％)。此外，在小麦、大麦和高粱等植物性饲料或者食品原料中也存在大量的木聚糖。在木聚糖转化方面，木聚糖酶能够将半纤维素、玉米芯、麸皮等非淀粉多糖转化为木聚寡糖，作为一类功能性低聚糖在维持肠道健康、免疫调节、饮料和食品添加剂等方面具有重要的应用价值；在食品烘焙方面，由于木聚糖是小麦面粉中的重要功能性成分，影响面团的特性和烘焙制品的品质，而木聚糖酶在水解产生木聚糖寡糖的同时，也会改变面粉中多糖、蛋白及脂等组分的相互作用，从而在提高面制品品质、延长货架期等方面具有重要的作用；在饲料领域，木聚糖难以被动物快速消化吸收，而木聚糖酶能够将饲料中的非淀粉多糖
‑
木聚糖水解，从而改善饲料的性能。目前多数报道的木聚糖酶在催化特性研究中主要以山毛榉木聚糖、玉米芯木聚糖以及燕麦葡聚糖等外源化学提取的木聚糖作为反应底物。由于木聚糖在植物细胞壁中与其他类型多糖相互交联，实际结构较为复杂，导致多数木聚糖酶无法发挥催化作用，这也是只有少数木聚糖酶应用于食品烘焙和饲料等行业的原因之一。
[0003]木聚糖酶(EC 3.2.1.8)作为一种重要的工业用酶，广泛的应用于食品、饲料、造纸、木聚糖转化等领域。木聚糖酶根据其结构与生化特性主要归类为糖苷水解酶第8家族，第10家族和第11家族，也有部分报道的木聚糖酶分布在第5、7、30和43家族等。目前，专利报道的木聚糖酶主要来源于芽孢杆菌和木霉与曲霉(ZL 201210529320.7)，链霉菌(ZL 201410752428.1)等微生物，其中，耐高温以及酸碱稳定性木聚糖酶的鉴定(ZL201510947137.2；ZL201510577598.5)、木聚糖酶的高效生产(ZL 201810954604.8)以及木聚糖酶在木质纤维素转化等方面成为关注的重点。
[0004]在低温环境条件下工业酶保持较高的催化效率，在降低能耗污染负荷、提高绿色生物制造水平、减少碳排放等方面具有重要作用。然而，目前具有耐冷特性的木聚糖酶报道较少，已报道的耐冷性木聚糖酶主要来源于南极磷虾、单胞菌属、嗜中温居水菌等，主要分布在GH8和GH10家族。同时，具有耐冷活性的新型木聚糖酶的专利申请较少，且尚无应用评估的报道，主要归因于在低温环境条件下，酶较低的催化效率限制了其实际的工业应用。因此，为了降低因高温催化带来的能耗和污染负荷，开发具有低温高效催化性能的新型木聚糖酶具有重要的价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种具有耐冷特性的木聚糖酶及其编码基因，所述酶可以通过氨基酸序列基序(一级结构)、二级结构元件以及三级结构元件和氨基酸序列在线BLAST
比对来识别。该木聚糖酶来源于粘细菌，纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)。
[0006]本专利技术的另一目的是提供含有该木聚糖酶基因的基因工程菌。
[0007]本专利技术的又一目的是提供该基因以及该基因所编码的蛋白质的应用。
[0008]本专利技术所述木聚糖酶基因，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1，该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1377bp，G+C含量为67.03％，编码458个氨基酸，理论分子量大小为50.23KD，等电点为4.32。
[0009]本专利技术所述的木聚糖酶基因编码的木聚糖酶蛋白质,其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2，该蛋白N端前19个氨基酸为信号肽序列，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.3。所述的木聚糖酶最适反应pH为6.0，最适反应温度为50℃，并在30℃
‑
50℃(2h)和pH 5.0
‑
11.0(12h)之间保持活性稳定。
[0010]含本专利技术所述的重组质粒的重组微生物。
[0011]所述的重组微生物，优选以大肠杆菌、毕氏酵母和枯草芽孢杆菌为宿主菌。
[0012]本专利技术所述木聚糖酶基因在木聚糖低温转化、食品、烘焙或饲料领域的基因工程应用。所述的低温转化是4～10℃。
[0013]本专利技术所述木聚糖酶在木聚糖低温转化方面的应用，优选为以不同来源的木聚糖为底物制备低聚木聚寡糖，包括玉米芯和小麦麸皮等。所述的低温为4～10℃。
[0014]本专利技术所述木聚糖酶作为酶制剂在木聚糖转化、食品或饲料领域的生产应用。
[0015]本专利技术所述木聚糖酶作为酶制剂在面包烘焙中的应用。
[0016]有益效果
[0017]1.本专利技术以从土样中筛选出的粘细菌菌株纤维堆囊菌为材料，参考基因组序列信息并结合PCR扩增，成功获得木聚糖酶基因序列。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1377bp，G+C含量为67.03％，编码458个氨基酸，N端前19个氨基酸为信号肽。
[0018]2.该木聚糖酶基因表达的产物，通过DNS法(二硝基水杨酸法)测定还原糖的方法进行酶的活性进行测定，该木聚糖酶能高效的作用于山毛榉木聚糖、玉米芯木聚糖和小麦麸皮，以玉米芯木聚糖为底物时活力高达5546.9U/mg。
[0019]3.该木聚糖酶在4℃时依然具有较高的木聚糖催化活性，与最适温度相比其相对活性依然保留20％，表现出明显的低温催化特性。同时，对比与在50℃条件下，该木聚糖酶在4℃条件下表现出较高的底物亲和力。
[0020]4.所获得的重组木聚糖酶在木聚糖转化和食品烘焙方面表现良好的性能，作用于不同植物来源的木聚糖和小麦麸皮能够显著提高低聚木聚寡糖的含量，同时应用于面包烘焙中，该酶在0.05
‑
0.4mg/kg的添加剂量下，能够显著提高面包的体积和品质，延长面包的货架期，与商业化的木聚糖酶相比，在低添加剂量情况下显示出较好的有益效果。
附图说明
[0021]图1木聚糖酶编码基因的PCR扩增电泳图
[0022]图2重组木聚糖酶的SDS
‑
PAGE电泳图
[0023]M：蛋白marker；1：纯化的重组蛋白；2：含有目的基因的宿主细胞破碎上清；3：不含目的基因的宿主细胞破碎上清
[0024]图3木聚糖酶酶学性质
[0025]a:重组蛋白的温度稳定性；b：重组蛋白的最适温度；c：重组蛋白的pH稳定性；d：重组蛋白的最适pH
[0026]图4木聚糖酶对不同来源木聚糖的水解产物分析
[0027]山毛榉木聚糖和玉米芯木聚糖作为底物，木聚糖酶在4℃和50℃条件下水解底物的产物利用薄层层析进行分析
[0028]图5木聚糖酶在食品烘焙中的应用
[0029]生物材料保藏信息
[0030]Sorangium cellulosum S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种木聚糖酶基因，其特征在于该基因全长核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。2.权利要求1所述的木聚糖酶基因编码的具有耐冷特性的木聚糖酶，其特征在于氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。3.含权利要求1所述木聚糖酶基因的重组质粒。4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于所述的重组质粒是将权利要求1所述木聚糖酶基因克隆到质粒pET29a或pEFαA中所得。5.含权利要求1所述的木聚糖酶基因或权利要求3或4所述的重组质粒的重组微生物。6.根据权利要求5所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔中利，李周坤，李旭，钟玲丽，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：