用于制备UDP-半乳糖的酶方法技术

本发明专利技术涉及在单一反应混合物中从低成本底物尿苷一磷酸和D

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制备UDP
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半乳糖的酶方法
专利

[0001]本专利技术涉及在单一反应混合物中从低成本底物尿苷一磷酸和D
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半乳糖产生UDP
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半乳糖的酶催化方法。所述方法能够(半)连续地、以间歇或加料
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间歇模式或任何其它操作模式操作。此外，能够调整所述方法以产生半乳糖基化的分子和生物分子包括糖，特别是人乳寡糖(HMO)，蛋白质，糖蛋白，特别是抗体，糖肽，和生物缀合物，特别是碳水化合物缀合物疫苗和抗体
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药物缀合物。
[0002]专利技术背景
[0003]尿苷5
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二磷酸基
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α
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D
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半乳糖(UDP
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半乳糖或UDP
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Gal)是许多生物技术应用和食品技术的关键底物。它是用来治疗自身免疫性疾病的治疗性抗体的半乳糖基化底物。另外，为了制备碳水化合物疫苗以及在增长中的个人化医药领域(即制备用于药物递送的糖纳米材料)中需要UDP
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半乳糖。在婴儿食品(人乳)中，半乳糖基化的寡糖构成人乳寡糖的重要组分，和从而有在合成产生的婴儿乳品中包括半乳糖基化的糖的高需求(Carbohydrate Research 432(2016)62
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70)。
[0004]然而，尽管有对UDP
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半乳糖的高需求(数量级为每年按吨计)，但UDP
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半乳糖的可获得性非常有限，甚至对于研究者也如此。迄今，UDP
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半乳糖的价格是约2,000美元每克。由于UDP
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半乳糖的高价格，不仅基础和应用研究活动受到妨碍，而且工业应用也被阻碍。
[0005]合成UDP
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半乳糖的生物工程改造策略能够分为体内和体外方法：在代谢上工程改造微生物以便作为其代谢的一部分在细胞内或细胞外产生UDP
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半乳糖。然而，缺点是低收率，高水平的不希望副产物，细胞系设计需要的时间和复杂的放大。考虑到法规方面，特别是对于婴儿食品，转基因生物(GMOs)的应用能够严重延缓审批进程。
[0006]U.S.专利申请No.09/757,846和Liu et al.(ChemBioChem,2002,3,348
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355)公开用产生糖核苷酸的酶和糖基转移酶在体外产生糖缀合物的方法。UDP
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Gal通过7酶级联制备，起始自昂贵的葡萄糖1
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磷酸和UDP
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葡萄糖，总收率35％。酶固定化在Ni NTA琼胶糖珠上，其对较大规模合成并不实用。酶在琼胶糖珠上弱结合并且在对最佳UDP
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Gal产生所必需的高离子强度的反应混合物中快速洗除。酶的洗除能够严重妨碍检验过程(特别是对于食品和药物施用)，并且使得必需在各次使用之后将珠再装填。此外，在大量的情况下有毒的镍离子从珠释放至溶液；由此使得它们在合成HMOS中的使用很有可能是不可行的。此外，Ni琼胶糖珠并非机械稳健的；由于其柔软度它们不能用于搅拌槽反应器中，原因是高剪切速率导致琼胶糖珠降解，或者由于压缩不能用于大规模柱填充中。半乳糖从降解的琼胶糖珠释放可以导致酶的底物中毒。
[0007]Koizumo et al.(Nature Biotech.1998,16,847)报告相似的UDP
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Gal合成，其除了半乳糖和乳清酸原料之外还使用葡萄糖1
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磷酸。UTP向半乳糖的转移用两种酶GalT和GalU实现。该方法在10％(v/v)二甲苯存在下进行，在21小时之后实现半乳糖的低反应收率29％。高浓度生物质的使用妨碍大规模应用，原因是显著的质量转移局限。此外，二甲苯具有中等急性毒性。
[0008]Muthana et al.(Chem.Commun.,2012,48,2728
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2730)报告从单糖和UTP一锅多酶
合成UDP
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糖，使用来自长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)(BLUSP)的混杂UDP
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糖焦磷酸化酶(USP,EC 2.7.7.64)。
[0009]长期以来都需要以成本有效的方式从低成本和可容易获得的底物开始产生UDP
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半乳糖的方法。
[0010]从而，本专利技术的目的是提供制备UDP
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半乳糖的成本有效的且有效率的方法。
[0011]本专利技术的目的通过独立权利要求的教导得以解决。本专利技术的其它有利特征、方面和细节则体现在本申请的从属权利要求、说明书、附图和实施例中。
[0012]专利技术描述
[0013]在生物化学中，核苷酸糖熟知是单糖的活性形式，而在糖基化反应中，核苷酸糖已知充当糖基供体。糖基转移酶(GTFs)是催化糖部分从活化的核苷酸糖向亲核的糖基受体分子转移的酶。从而，在生物化学中，糖基化反应被糖基转移酶催化。
[0014]为了充当糖基供体，各单糖必需呈高能量形式，例如核苷酸糖形式，特别是衍生自尿苷二磷酸、鸟苷二磷酸或胞嘧啶二磷酸的核苷酸二磷酸基糖等。熟知的核苷酸糖的实例是UDP
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葡萄糖，UDP
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半乳糖，UDP
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GlcNAc，UDP
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GalNAc，UDP
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木糖，UDP
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葡糖醛酸，GDP
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甘露糖和GDP
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岩藻糖。熟知的是，简单单糖向活化的核苷酸糖的转化能够通过核苷三磷酸(NTP)和糖基一磷酸的酶催化反应实现，其中所述糖基一磷酸含有在异头碳位置的磷酸基团。
[0015]为了获得核苷二磷酸(NDP)
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单糖，需要将所用单糖转化为糖基一磷酸衍生物。通常，所述反应能够通过应用特定酶比如磷酸转移酶和额外磷酸变位酶(如果需要)实现，从而获得所希望的单糖
‑1‑
磷酸。磷酸转移酶是分类为EC编号2.7的酶，其催化磷酸化反应。磷酸转移酶根据其受体分子进一步分类。例如，EC 2.7.1的磷酸转移酶是具有醇基团作为受体的磷酸转移酶。磷酸变位酶是异构酶，也即能够催化磷酸基团内部转移的酶。在底物经由磷酸转移酶磷酸化获得单糖
‑6‑
磷酸的情况下需要磷酸变位酶，比如D
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甘露糖或D
‑
葡萄糖的情况，分别例如甘露糖
‑6‑
磷酸和葡萄糖
‑6‑
磷酸。各磷酸变位酶然后催化磷酸基团的内部转移，这分别引起甘露糖
‑6‑
磷酸向甘露糖
‑1‑
磷酸或葡萄糖
‑6‑
磷酸向葡萄糖
‑1‑
磷酸转化。
[0016]激酶是形成磷酸转移酶家族的一部分的酶。激酶是催化磷酸基团从高能磷酸供给分子转移至特异性底物的酶。该过程称为磷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.产生尿苷5
′‑
二磷酸基
‑
α
‑
D
‑
半乳糖的方法，包括下述步骤：A)提供溶液，所述溶液包含(i)下式代表的尿苷一磷酸和D
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半乳糖(ii)多磷酸盐和腺苷三磷酸；和提供包含葡萄糖
‑1‑
磷酸尿苷酰基转移酶、半乳糖激酶、多磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的一组酶；B)在所述一组酶、多磷酸盐和腺苷三磷酸存在下，从尿苷一磷酸和D
‑
半乳糖产生尿苷5
′‑
二磷酸基
‑
α
‑
D
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半乳糖。2.根据权利要求1的方法，其中所述一组酶还包含焦磷酸酶。3.根据权利要求1或2的方法，其中所述一组酶还包含1
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域多磷酸激酶2。4.根据权利要求1
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3中任一项的方法，其中所述一组酶还包含2
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域多磷酸激酶2。5.根据权利要求1或4的方法，其中所述一组酶的至少一种酶固定化在固体载体上。6.根据权利要求1
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4中任一项的方法，其中所述一组酶共固定化在固体载体上。7.根据权利要求6的方法，其中所述一组酶从发酵肉汤、粗制细胞裂解液、纯化细胞裂解液或细胞匀化物直接共固定化在固体载体上。8.根据权利要求1
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7中任一项的方法，其中尿苷一磷酸和D
‑
半乳糖在步骤A)提供的溶液中的浓度范围是0.2mM至15,000mM。9.根据权利要求1
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8中任一项的方法，其中所述多磷酸盐是具有至少25个磷酸残基的长链多磷酸盐。10.根据权利要求1
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9中任一项的方法，其中在单一反应混合物中产生尿苷5
′‑
二磷酸基
‑
α
‑
D
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：马克斯，
类型：发明
国别省市：