肿瘤坏死因子-α作为一种核酸基因药物体内递送载体的应用制造技术

本发明专利技术公开了属于核酸药物研究领域中一种人体内源蛋白质分子作为新型核酸基因药物体内递送载体的发现与应用。本发明专利技术通过RNA免疫沉淀结合深度测序技术、RT

【技术实现步骤摘要】
肿瘤坏死因子-α
作为一种核酸基因药物体内递送载体的应用


[0001]本专利技术属于医药学领域，具体涉及一种新型核酸基因药物递送载体的发现和应用。

技术介绍

[0002]核酸基因药物是生物医药发展的前沿领域，包括反义核酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小激活RNA(saRNA)、信使RNA(mRNA)、适配体(aptamer)、核酶(ribozyme)、抗体核酸偶联药物(ARC)等，是基因治疗的一种形式，也是继小分子药物、蛋白药物、抗体药物之后的新一代制药技术。核酸基因药物能够以化学药物或抗体药物无法靶向(例如mRNA和miRNA)的分子作为作用靶点，有望对传统药物疗效不佳的疾病产生突破性的进展，特别是难以治疗的遗传疾病、癌症以及某些病毒感染(例如SARS-CoV-2)。考虑到DNA、mRNA、siRNA、microRNA等核酸类生物活性物质分子量大，不能独自进入细胞内，因而这些核酸基因类药物进入细胞成为此类药物发挥作用的技术瓶颈之一，新型核酸基因药物递送载体的研究与发现是核酸药物发展的重中之重。
[0003]目前核酸基因药物载体主要分为病毒类和非病毒类载体，前者包括腺相关病毒(adenovirus-associated virus，AAV)、慢病毒(lentivirus)、腺病毒(adenovirus)和逆转录病毒(Retrovirus)等，后者包括脂质体、纳米颗粒、微囊泡、外泌体等。从已上市药物情况来看，病毒载体、脂质体在DNA基因药物递送较为成熟，小核酸基因药物则更多采用脂质体、ASO及GalNAc等载体或技术平台。无论是何种递送方式，其递送效率、稳定性、免疫原性、细胞毒性等都存在一些问题。因此，寻找一种新的、天然的、高效的、无毒的递送载体迫在眉睫。
[0004]肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一个典型的促炎性细胞因子，在肿瘤发生中具有双重作用，其主要来源于单核细胞和巨噬细胞，非免疫细胞如内皮细胞、神经细胞也可分泌。TNF-α有两种存在形式，分子量为26kD的膜结合型与分子量为17kD的可溶性形式，可溶性TNF-α为其主要功能形式。膜结合型TNF-α经过TNF-α转化酶(TACE，即ADAM17)剪切，形成可溶性TNF-α(主要功能形式)，与细胞表面TNF-α受体(TNFR1与TNFR2)结合，发挥抗感染、促进组织修复、破坏肿瘤血管系统、诱导细胞凋亡等多种抗肿瘤作用。在慢性炎症中，TNF-α的促肿瘤作用也已被证实。研究表明，健康人血清中TNF-α含量在10pg/mL以下，而当体内形成炎症病征时，血清中TNF-α含量可以提高至少5-10倍，病灶处浓度更高。TNF-α大量产生和释放会破坏机体的免疫平衡，造成病理损伤，导致多种疾病发生。大量研究表明，在今年爆发的新型冠状病毒感染的肺炎患者中，中度和重度感染病人的TNF-α显著上调。
[0005]专利技术人通过前期研究基础发现TNF-α具有RNA结合蛋白的生物学功能，即重组可溶性性人源TNF-α能够与随机68nt RNA结合，在体外具有RNA伴侣分子的活性，然而TNF-α是否是miRNA结合蛋白目前尚无文献报道。专利技术人通过研究发现，可溶性TNF-α可以结合microRNA并将其带入到细胞内，影响细胞增殖能力，说明TNF-α作为一种天然的、新型核酸递送载体的可能性。同时专利技术人通过序列分析结合仪gator确定了TNF-α结合microRNA的特
异碱基，发现连接poly U的任意microRNA与TNF-α的结合均有明显增强，这说明任意核酸分子连接poly U都可以实现通过TNF-α递送到细胞内，实现任意核酸的天然、高效的递送。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于发现一种天然的核酸药物递送载体，即可溶性TNF-α蛋白。
[0007]本专利技术的目的还在于提供上述核酸基因药物递送载体的鉴定方法。
[0008]本专利技术的目的还在于提供上述核酸基因药物递送载体在核酸基因药物递送中的应用。
[0009]本专利技术的目的还在于提供以结合可溶性TNF-α蛋白的核酸基因药物的应用，包括但不限于microRNA、siRNA、反义RNA、核酸适配体、核酶、mRNA及其类似物。
[0010]上述核酸基因药物递送载体的鉴定方法，其特征在于，TNF-α在体外具有RNA伴侣分子的活性，能够与随机68nt的RNA结合。EMSA、生物大分子相互作用仪gator可以确定TNF-α与microRNA结合能力，激光共聚焦、流式细胞检测确定TNF-α转运外源microRNA到细胞内。细胞增殖、细胞迁移实验验证了进入细胞内的外源microRNA具有促进细胞生长和迁移的功能。
[0011]上述核酸基因药物递送载体在核酸基因药物递送中的应用。
[0012]本专利技术的有益效果：本专利技术利用EMSA、生物大分子相互作用仪gator等方法证实，可溶性TNF-α蛋白是可以与microRNA结合的。以结直肠癌细胞株HCT116细胞为模型，利用激光共聚焦显微镜、流式细胞仪证实可溶性TNF-α蛋白可以转运外源microRNA进入细胞。利用细胞增殖和细胞迁移实验，证实可溶性TNF-α蛋白可以结合并转运microRNA进入细胞，促进细胞增殖和细胞迁移。
附图说明
[0013]图1为TNF-α与miRNA体外结合实验的FMSA结果。
[0014]图2为Gator测定TNF-α与不同的miRNA的结合情况。
[0015]图3为Gator测定TNF-α与miR-146a结合亲和力测定结果。
[0016]图4为Gator测定TNF-α与加poly U的miRNA的结合情况。
[0017]图5为TNF-α的细胞内化实验Western blot结果。
[0018]图6为细胞流式检测TNF-α转运外源miRNA进入结直肠癌细胞结果。
[0019]其中，左图为TNF-α转运miR-146a的情况，右图为TNF-α转运let-7c的情况；TNF-α为绿色荧光标记，miRNA为红色荧光标记。
[0020]图7为激光共聚焦检测TNF-α转运外源mi-146a进入结直肠癌细胞的结果。
[0021]其中，TNF-α为AF488标记，显示为绿色；miRNA为Cy3标记，显示为红色；细胞核为DAPI染色，显示为蓝色。
[0022]图8为激光共聚焦检测TNF-α转运带polyU的外源miRNA进入结直肠癌细胞的结果。
[0023]其中，TNF-α为AF488标记，显示为绿色；miRNA为Cy3标记，显示为红色；细胞核为DAPI染色，显示为蓝色。上排miR-21为阴性对照，TNF-α无法结合并转运其进入细胞；下排为带polyU后，TNF-α可以结合并转运其进入细胞。
[0024]图9为细胞增殖和细胞迁移实验检测TNF-α转运miRNA进入细胞促进结直肠癌增殖
和迁移；
[0025]其中，上图为细胞增殖实验，下图为细胞迁移实验。
具体实施方式
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型核酸基因药物体内递送载体的发现，其特征在于，所述递送载体为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。2.权利要求1所述核酸基因药物体内递送载体为可溶性TNF-α。3.权利要求1所述核酸基因药物体内递送载体的作用形式，其特征在于，TNF-α蛋白体外直接与小核酸基因药物孵育后，可以将核酸基因药物递送至细胞内。4.权利要求1所述核酸基因药物体内递送...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵宁生，赵越超，董洁，刘雪梅，李慧，黄皑雪，王琳，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：