特异识别金葡菌肠毒素B的核酸适配体3-2和2-27的序列及应用制造技术

本发明专利技术公开了属于分子生物医学技术领域的两条特异识别金葡菌肠毒素B的核酸适配体3

【技术实现步骤摘要】
特异识别金葡菌肠毒素B的核酸适配体3
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2和2
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27的序列及应用
专利
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[0001]本专利技术涉及两条特异识别金葡菌肠毒素B的核酸适配体3
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2、2
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27的序列和修饰，以及 修饰后的3
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2、2
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27在识别金葡菌肠毒素B方面的应用。本专利技术涉及3
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2、2
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27在生物医药 方面的应用。3
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2、2
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27作为试剂盒的组成部分或者检测指标，用于金葡菌肠毒素B的检测 或者抗金葡菌感染发生、发展、进程相关的基础研究及靶向药物研制等。

技术介绍
：
[0002]指数富集的配基系统进化技术，简称SELEX(Systematic Evolution of Ligands byEXponential Enrichment)技术，是近十几年兴起并迅速得到发展的高通量生物文库筛选技术。 应用大容量的随机寡核苷酸文库(ssDNA文库和RNA文库)，结合PCR体外扩增技术，以 指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过反复的体外筛选、扩增，最终获得的核酸适 配体(aptamer)基于空间结构与靶分子呈高特异性和高亲和力的结合。由于核酸适配体具有 精确识别、无免疫原性、易体外合成与修饰等优点，又称为“人工替代抗体”，在基础医学、 临床诊断与新药研发等方面具有广阔的应用前景。尤其是近年来兴起的复合靶SELEX技术， 使得对未知靶分子进行筛选成为可能，并且通过引入消减筛选步骤，能够获得特异识别两组 复合靶子中差异存在分子的核酸适配体，并能利用该配基反过来对差异靶分子进行研究，这 就为开发新型分子探针以及鉴定生物标志物开辟了新的途径。
[0003]金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcalenterotoxins，SEs)是由金黄色葡萄球菌和化脓性 链球菌分泌的超级抗原。SEs是免疫系统的有效激活剂。金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)和 相关的超抗原毒素是免疫系统的有效激活剂。这些蛋白质毒素直接与抗原呈递细胞上的主要 组织相容性复合物(MHCII)类分子和T细胞受体(TCR)的特定Vβ区结合，导致单核细 胞、巨噬细胞和T淋巴细胞均被激活，引发早期的“细胞因子风暴”和大规模的多克隆T细 胞增殖。使得促炎细胞因子：肿瘤坏死因子α(TNF
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α)，白介素1(IL
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1)，IL
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2，干扰素γ (IFN
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γ)和巨噬细胞趋化蛋白1等大量释放，引起发热，炎症，多器官损伤，低血压和致 死性休克等疾病。SEB被美国疾病控制与预防中心(CentersforDiseaseControlandPrevention，简 称cdc)认定为B类精选制剂。SEB中毒通常是在食用加工过的肉类或奶制品后(处理和储存 不当)而引起的食物中毒。除了造成食物中毒，SEB还被用作生物战剂，吸入SEB后2小时 内可引起以下症状：头痛、肌肉疼痛、心动过速、咳嗽、恶心、呕吐、腹泻和结膜刺激。这些 形式的失能发生在毫微克水平，而微克的SEB可能是致命的。
[0004]本专利技术是通过SELEX技术获得了两条核酸适配体3
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2、2
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27。经鉴定，核酸适配体3
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2、 2
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27能够特异识别金葡菌肠毒素B，而不结合其他蛋白，对照核酸序列与上述蛋白均无结合， 目前虽见到文献有报道特异结合金葡菌肠毒素B的核酸适配体的相关研究报道，但是我们筛 选获得的适配体序列与文献报道的适配体序列并不一样，类似于针对同一抗原可以有不同结 合位点的抗体，由于其筛选的初始文库不同，因此针对同一靶标SEB，不同的适配体与其结 合的位点也会不同。因此本专利技术中的适配体3
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2、2
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27的序列具有独创性和
新颖性。

技术实现思路
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[0005]本专利技术目的在于提出特异识别金葡菌肠毒素B的核酸适配体3
‑
2、2
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27的序列及其应用 领域，包括核酸适配体3
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2、2
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27作为试剂盒的组成部分或者检测指标，用于金葡菌肠毒素 B的检测或者抗金葡菌感染发生、发展、进程相关的基础研究及靶向药物研制等
[0006]本专利技术通过以下技术方案实现：
[0007]首先由生工公司合成P7
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26序列，并在5
’
端或3
’
端修饰、标记(如生物素)，然后进 行应用研究：ELISA方法或滤膜
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化学发光法检测3
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2、2
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27识别金葡菌肠毒素B。
[0008]本专利技术优点：
[0009]1)与蛋白类的抗体相比，核酸适配体更加稳定；核酸适配体可直接体外合成、标记，因此 不需要标记的二抗，使得操作更为简单、迅速；核酸适配体的合成成本较抗体制备成本 低，周期短。
[0010]2)本专利技术证实核酸适配体3
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2、2
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27序列特异识别金葡菌肠毒素B。因此，核酸适配体3
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2、 2
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27序列在生防与疾控等方面的研究相关领域中均具有广泛的应用价值和广阔的市场前 景。
附图说明：
[0011]图1 ELISA实验证实适配体3
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2、2
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27所结合的靶标为金葡菌肠毒素B。
[0012]图2滤膜
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化学发光法实验证实适配体3
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2、2
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27所结合的靶标为金葡菌肠毒素B。
[0013]图3 ELISA实验证明3
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2、2
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27特异识别金葡菌上清中的SEB，而对照序列无结合。图4适配体3
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2与金葡菌肠毒素B结合的平衡解离常数(KD值)的测定.图5适配体2
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27与金葡菌肠毒素B结合的平衡解离常数(KD值)的测定
具体实施方式：
[0014]下面通过适配体3
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2、2
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27对金葡菌肠毒素B的识别来进一步描述本专利技术。
[0015]本专利技术通过以下技术方案实现：
[0016]1.通过生物素标记的3
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2、2
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27对金葡菌肠毒素B的特异识别来进一步描述本专利技术。
[0017]1.1合成3
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2、2
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27(序列表中SEQ ID No.1、NO.2)和无关对照序列
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GP30(序列表中SEQ ID No.3)，通过公司合成使3
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2、2
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27和GP30的5
’
端标记上Bio。
[0018]Bio
‑3‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.两条特异识别金葡菌肠毒素B的单链DNA核酸适配体3
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2、2
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27的序列，其特征在于，所述的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.1、No.2所示。2.据权利要求1中所述方法，核酸适配体3
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2、2
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27可以是体外化学合成的，也可以是通过PCR或其他分子生物学方法制备的。3.据权利要求1中所述方法，核酸适配体3<...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵宁生，李慧，张敏，刘雪梅，陈国江，黄皑雪，赵越超，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：