白细胞介素2调节肿瘤巨噬细胞生成的外泌体分泌成分抑制肝细胞癌的生长和转移方法技术

本发明专利技术公开了一种白细胞介素2(IL

【技术实现步骤摘要】
白细胞介素2调节肿瘤巨噬细胞生成的外泌体分泌成分抑制肝细胞癌的生长和转移方法


[0001]本专利技术涉及外泌体基因治疗
，尤其涉及一种白细胞介素 2调节肿瘤巨噬细胞生成的外泌体分泌成分抑制肝细胞癌的生长和转移方法。

技术介绍

[0002]原发性肝细胞癌(HCC)是一种常见的恶性肿瘤，在癌症死亡率中排第三位。HCC的治疗主要是手术切除和肝移植。由于其恶性程度高，五年生存率仍不足50％，复发率高。复发转移已成为提高肝癌治疗效果和生存率的最大障碍。肿瘤的发生、发展、侵袭和转移不仅由恶性肿瘤细胞本身决定，还与肿瘤微环境密切相关。肿瘤微环境中存在大量的肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)。肿瘤细胞与其微环境之间的相互作用早已被确立为肿瘤发生和转移的主要标志。为此，已对肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)进行了广泛研究，并发现它们通常与各种癌症的不良预后相关。最近的研究证实，TAMs主要是M2型巨噬细胞，可以通过影响血管生成、免疫抑制、侵袭和转移来促进肿瘤生长。外泌体是直径为30
‑
150nm的膜囊泡。外泌体可以分泌并广泛存在于各种体液中。外泌体携带亲代细胞的RNA和蛋白质成分，参与肿瘤的信号转导和免疫逃逸以及一些疾病的诊断和治疗。据报道，源自TAMs的外泌体促进HCC细胞增殖和转移。白细胞介素2(IL
‑
2)是免疫系统中的一种多功能细胞因子，可有效激活和增强巨噬细胞的吞噬和杀伤能力。IL
‑
2已在许多临床试验中用于治疗HCC。然而，IL
‑
2是否调节从TAMs释放的外泌体成分从而抑制HCC仍然未知。鉴于IL
‑
2 在HCC中的新兴作用和调节巨噬细胞的功能，本专利技术旨在探索来自 IL
‑
2处理的TAMs的外泌体对HCC发生发展的一种方法。

技术实现思路

[0003]针对传统技术的上述不足，本专利技术为IL
‑
2抑制肝细胞癌的机制提供了新的视角和方法，并暗示了TAMs释放的外泌体成分的潜在临床价值。
[0004]本专利技术提出的白细胞介素2调节肿瘤巨噬细胞生成的外泌体分泌成分抑制肝细胞癌的生长和转移方法，具体调节方法包括以下步骤：
[0005]S1、原发性肝癌标本收集和肿瘤相关巨噬细胞分离，用剪刀将人新鲜肿瘤样品切碎，分离和培养巨噬细胞；
[0006]S2、外泌体分离和纯化，用试剂盒提取外泌体，用红色荧光接头 PKH26标记纯化的外泌体；
[0007]S3、透射电子显微镜观察的外泌体和TAMs细胞；
[0008]S4、RNA分离和qPCR，使用Trizol试剂从细胞或小鼠组织中分离总RNA，然后使用实时qPCR和实时荧光定量PCR试剂盒分析 RNA；
[0009]S5、Western blot蛋白分析，外泌体或细胞在含有蛋白酶抑制剂的RIPA中裂解，总共20μg的外泌体通过SDS
‑
PAGE分离并转移到PVDF膜，然后将膜与抗体CD63、Calnexin、PCNA、细胞周期蛋白D1、E
‑
cadherin、N
‑
cadherin、微管蛋白、Bax、Bcl
‑
2、MMP
‑
2 和MMP
‑
9孵
育过夜；
[0010]S6、CCK
‑
8和EDU测定增殖
[0011]S7、通过流式细胞术定量细胞凋亡；
[0012]S8、迁移测定和滑痕分析；
[0013]S9、实验动物异种移植小鼠模型，将处于对数生长期的QJY
‑
7703 细胞制备成细胞悬液，腋窝皮下注射细胞(5
×
105)BALB/c裸鼠， 4
‑
6周龄，每组n＝6，每2天尾静脉注射外泌体40ug/mL，共7次，5 天后每10天测量一次肿瘤体积，直到30天后处死小鼠；
[0014]S10、肝肺转移实验；
[0015]S11、TUNEL染色；
[0016]S12、生物信息学分析和结果。
[0017]作为优选，所述步骤S1的具体步骤为：
[0018]S1
‑
1、准备无菌饭盒，内放置盛有无血清DMEM液的培养皿；
[0019]S1
‑
2、用剪刀和手术刀片剔除可见的大血管和单管结构以去除内皮细胞的污染，剔除坏死组织、结缔组织和血液等杂物，用PBS洗涤三次；
[0020]S1
‑
3、在10cm培养皿中用剪刀和手术刀片将组织切碎后，组织块浸入含0.1％1V型胶原酶的无钙无镁Hank
’
s平衡盐溶液中，放入 37℃的二氧化碳培养箱中消化40分钟，每隔5分钟用吸管捶打一次使细胞分离：
[0021]S1
‑
4、利用钝器机械研磨组织以剔除内皮细胞；
[0022]S1
‑
5、得到的细胞悬液经75pm尼龙薄纱滤网：
[0023]S1
‑
6、滤液4℃下70g转速下离心3分钟两次以去除肝实质细胞，得到肝非实质细胞；
[0024]S1
‑
7、PBS清洗上清液中的肝非实质细胞，4℃下650g转速离心 7分钟；
[0025]S1
‑
8、细胞沉淀PBS重悬，在25％和50％Percoll细胞分离液中离心15分钟，温度为4℃，转速为1800rpm；
[0026]S1
‑
9、收集最上层细胞组分，加入红细胞裂解液，经PBS清洗两次，得到巨噬细胞；
[0027]S1
‑
10、巨噬细胞纯度经流式细胞术检测CD68阳性率，肝癌细胞为Huh7,HepG2 and QJY
‑
7703，肿瘤细胞系外购，在收集上清液之前，接着用20ng/mlIL
‑
2孵育处理TAM 24小时。
[0028]作为优选，所述步骤S1
‑
10中，孵育处理具体步骤为：
[0029]S1
‑
10
‑
1、明确IL
‑
2对TAMs表型的影响，
[0030]S1
‑
10
‑1‑
1、分离HCC组织中的TAMs，利用CD68免疫荧光实验检测其纯度；
[0031]S1
‑
10
‑1‑
2、20ng/mL IL
‑
2对TAMs处理不同时间点，制备样品，通过透射电镜观察其形态变化；
[0032]S1
‑
10
‑
2、确定IL
‑
2对TAMs外泌体分泌的影响以及外泌体是否可以在TAMs和肝癌细胞之间传递，
[0033]S1
‑
10
‑2‑
1、提取TAMs来源外泌体，采用SBI公司外泌体提取试剂盒分离TAMs本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种白细胞介素2调节肿瘤巨噬细胞生成的外泌体分泌成分抑制肝细胞癌的生长和转移方法，其特征在于，具体调节方法包括以下步骤：S1、原发性肝癌标本收集和肿瘤相关巨噬细胞分离，用剪刀将人新鲜肿瘤样品切碎，分离和培养巨噬细胞；S2、外泌体分离和纯化，用试剂盒提取外泌体，用红色荧光接头PKH26标记纯化的外泌体；S3、透射电子显微镜观察的外泌体和TAMs细胞；S4、RNA分离和qPCR，使用Trizol试剂从细胞或小鼠组织中分离总RNA，然后使用实时qPCR和实时荧光定量PCR试剂盒分析RNA；S5、Western blot蛋白分析，外泌体或细胞在含有蛋白酶抑制剂的RIPA中裂解，总共20μg的外泌体通过SDS
‑
PAGE分离并转移到PVDF膜，然后将膜与抗体CD63、Calnexin、PCNA、细胞周期蛋白D1、E
‑
cadherin、N
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cadherin、微管蛋白、Bax、Bcl
‑
2、MMP
‑
2和MMP
‑
9孵育过夜；S6、CCK
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8和EDU测定增殖S7、通过流式细胞术定量细胞凋亡；S8、迁移测定和滑痕分析；S9、实验动物异种移植小鼠模型，将处于对数生长期的QJY
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7703细胞制备成细胞悬液，腋窝皮下注射细胞(5
×
105)BALB/c裸鼠，4
‑
6周龄，每组n＝6，待瘤体肉眼可见时，每2天尾静脉注射外泌体，共7次，10天后每5天测量一次肿瘤体积，直到30天后处死小鼠；S10、肝肺转移实验；S11、TUNEL染色；S12、生物信息学分析和结果。2.根据权利要求1所述的白细胞介素2调节肿瘤巨噬细胞生成的外泌体分泌成分抑制肝细胞癌的生长和转移方法，其特征在于，所述步骤S1的具体步骤为：S1
‑
1、准备无菌饭盒，内放置盛有无血清DMEM液的培养皿；S1
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2、用剪刀和手术刀片剔除可见的大血管和单管结构以去除内皮细胞的污染，剔除坏死组织、结缔组织和血液等杂物，用PBS洗涤三次；S1
‑
3、在10cm培养皿中用剪刀和手术刀片将组织切碎后，组织块浸入含0.1％1V型胶原酶的无钙无镁Hank
’
s平衡盐溶液中，放入37℃的二氧化碳培养箱中消化40分钟，每隔5分钟用吸管捶打一次使细胞分离：S1
‑
4、利用钝器机械研磨组织以剔除内皮细胞；S1
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5、得到的细胞悬液经75pm尼龙薄纱滤网：S1
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6、滤液4℃下70g转速下离心3分钟两次以去除肝实质细胞，得到肝非实质细胞；S1
‑
7、PBS清洗上清液中的肝非实质细胞，4℃下650g转速离心7分钟；S1
‑
8、细胞沉淀PBS重悬，在25％和50％Percoll细胞分离液中离心15分钟，温度为4℃，转速为1800rpm；S1
‑
9、收集最上层细胞组分，加入红细胞裂解液，经PBS清洗两次，得到巨噬细胞；S1
‑
10、巨噬细胞纯度经流式细胞术检测CD68阳性率，肝癌细胞为Huh7,HepG2 and QJY
‑
7703，肿瘤细胞系外购，在收集上清液之前，接着用20ng/mlIL
‑
2孵育处理TAM 24小时。3.根据权利要求2所述的白细胞介素2调节肿瘤巨噬细胞生成的外泌体分泌成分抑制
肝细胞癌的生长和转移方法，其特征在于，所述步骤S1
‑
10中，孵育处理具体步骤为：S1
‑
10
‑
1、明确IL
‑
2对TAMs表型的影响，S1
‑
10
‑1‑
1、分离肝癌组织中的TAMs，利用CD68免疫荧光实验检测其纯度；S1
‑
10
‑1‑
2、20ng/mL IL
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2对TAMs处理不同时间点，制备样品，通过透射电镜观察其形态变化；S1
‑
10
‑
2、确定IL
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2对TAMs外泌体分泌的影响以及外泌体是否可以在TAMs和肝癌细胞之间传递，S1
‑
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‑2‑
1、提取TAMs来源外泌体，采用SBI公司外泌体提取试剂盒分离TAMs培养上清液中的外泌体，利用电子显微镜观察分离物的形态，通过Nanosight检测分离物的直径分布情况；S1
‑
10
‑2‑
2、利用Westernblot检测marker CD63，以及阴参Calaexin对外泌体进行鉴定；S1
‑
10
‑2‑
3、用荧光染料PKH26标记TAMs来源外泌体，在细胞水平，利用外泌体刺激肝癌细胞24h，荧光显微镜检测其是否被标记上红色荧光；S1
‑
10
‑
3阐明IL
‑
2诱导的TAMs外泌体对离体肝癌细胞的生长、迁移的影响，S1
‑
10
‑3‑
1、先从离体水平检测IL
‑
2处理的TAMs来源的外泌体对肝癌细胞增殖的影响，分为PBS对照组、Exo
TAM
和Exo
IL2
‑
TAM
三组，分别...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈浩，刘先苗，刘先春，
申请(专利权)人：深圳玄鸟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：