一种重组融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种重组融合蛋白及其应用。本发明专利技术提供了一种重组IL

【技术实现步骤摘要】
一种重组融合蛋白及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
更具体地，涉及一种重组融合蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]人白细胞介素
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10(Interleukin
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10,IL
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10)是由Vieira于1991年从破伤风毒性特异性T细胞克隆和表达，其基因位于1号染色体1q32区域，DNA全长4.7kb，包含5个外显子，其功能蛋白是由二硫键非共价结合而成的同源二聚体，分子量35kD，每个亚基含有178个氨基酸，包括18个氨基酸的信号肽，和鼠类IL
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10的同源性约为75％。人IL
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10受体是IL
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10R1和IL
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10R2异源二聚体，属于II类细胞因子受体。IL
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10及其受体相互作用是首先高亲和力与IL
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10R1结合，而后通过空间构想改变再与IL
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10R2结合，进而介导JAK
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STAT途径的信号转导。
[0003]几乎所有淋巴细胞均能合成IL
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10，主要来源是由单核巨噬细胞和T辅助细胞分泌，在多种类型的免疫细胞中具有免疫抑制或免疫刺激双向调节功能：一方面抑制Th1细胞应答及细胞因子的合成，抑制Th2细胞产生IL
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4和IL
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5，抑制巨噬细胞的抗原递呈功能及免疫介质的释放，但不能抑制Th17细胞产生IL
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17，也似乎对CD8+T细胞没有直接抑制作用；另一方面促进B细胞增殖分化及抗体产生，NK细胞的细胞毒活性、肥大细胞和T细胞活性。
[0004]目前，以IL
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10为靶点的药物仍然没有被批准上市，且处于研究阶段的药物绝大多数是用于治疗自身免疫疾病和慢性炎症，而用于治疗肿瘤的产品仅有聚乙二醇(PEG)化的IL
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10，例如Pegilodecakin和IL
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10Synthorin。然而，天然IL
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10的半衰期仅有几个小时，即使表面被PEG化后其半衰期也仅有几天，且高剂量会产生毒副作用。因此，开发抗肿瘤活性显著、无毒副作用的以IL
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10为靶点的抗肿瘤药物具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决以下技术问题之一：
[0006](1)IL
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10融合蛋白在生产过程中易发生降解或截短，产生异质性；
[0007](2)IL
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10融合蛋白中IgG Fc片段的铰链区存在的游离半胱氨酸容易导致产品聚集；
[0008](3)部分N
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糖基化位点会造成免疫原性，导致产品的安全性降低；
[0009](4)人IL
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10作为药物治疗相关疾病时的血浆半衰期很短。
[0010]本专利技术的目的是提供一种重组融合蛋白，包括IL
‑
10、连接肽和IgG Fc片段，所述IL
‑
10的C末端通过连接肽连接至IgG Fc片段的N末端，所述IL
‑
10与野生型IL
‑
10相比缺失N末端的Ser和Pro。
[0011]在一些实施方式中，所述连接肽的序列如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10所示。
[0012]在一些实施方式中，所述IgG Fc片段的铰链区依照EU编号在第220位的Cys被Ser取代。
[0013]在一些实施方式中，所述IgG Fc片段依照EU编号在第235位的Leu被Ala取代、第
237位的Gly被Gln取代或第327位的Ala被Gln取代。
[0014]本专利技术还提供了所述融合蛋白相关核酸、载体、细胞或药物组合物。
[0015]本专利技术还涉及所述融合蛋白、所述核酸、所述载体、所述细胞或所述药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
附图说明
[0016]图1是构建得到的含有目的基因的pCDNA3.4A
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R0356载体示意图。
[0017]图2是构建得到的含有目的基因的pCDNA3.1
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M1载体示意图。
[0018]图3是构建得到的含有目的基因的pCDNA3.1
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M2载体示意图。
[0019]图4是构建得到的含有目的基因的pCDNA3.1
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M3载体示意图。
[0020]图5是R0356的SEC检测结果图。
[0021]图6是M1的SEC检测结果图。
[0022]图7是M2的SEC检测结果图。
[0023]图8是M3的SEC检测结果图。
[0024]图9是R0356的质谱检测结果图。
[0025]图10是重组IL
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10
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Fc融合蛋白在细胞水平与IL
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10的受体IL
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10R1的结合情况测定结果图；图中，“Isotype”代表未融合IL
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10的IgG1蛋白；“HillSlope”代表EC50处曲线的斜率，“Span”代表EC50处曲线的上平台值。
[0026]图11是报告基因检测生物活性结果图；“HillSlope”代表EC50处的斜率。
[0027]图12是肿瘤生长曲线图。
具体实施方式
[0028]以下结合具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。
[0029]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0030]本专利技术涉及一种重组融合蛋白，包括IL
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10、连接肽和IgG Fc片段，所述IL
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10的C末端通过连接肽连接至IgG Fc片段的N末端，所述IL
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10与野生型IL
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10相比缺失N末端的Ser和Pro。
[0031]本专利技术通过截短IL
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10的N末端的Ser和Pro两个氨基酸，降低或消除了由于IL
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10融合蛋白降解或截短而导致的产品异质性。
[0032]在一些实施方式中，所述Fc选自IgG1 Fc，IgG2 Fc，IgG3Fc或IgG4 Fc中的任一种。
[0033]在优选实施方式中，所述Fc是IgG1 Fc。
[0034]在本专利技术中，IgG Fc包含IgG CH2和IgG CH3域。IgG1 Fc，IgG2 Fc，IgG3Fc，IgG4 Fc分别表示IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc。
[0035]在本专利技术中，术语“Fc”用于定义抗体重链中至少含有恒定区的一部分的C端区域。
[0036]在一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组融合蛋白，包括IL
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10、连接肽和IgG Fc片段，其特征在于，所述IL
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10的C末端通过连接肽连接至所述IgG Fc片段的N末端，所述IL
‑
10与野生型IL
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10相比缺失N末端的Ser和Pro。2.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述连接肽的序列如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10所示。3.根据权利要求1或2所述融合蛋白，其特征在于，所述IgG Fc片段的铰链区依照EU编号在第220位的Cys被Ser取代。4.根据权利要求1
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3任一所述融合蛋白，其特征在于，所述IgG Fc片段依照EU编号在第235位的Leu被Ala取代、第237位的Gly被Ala取代和第327位的Ala被Gln取代。5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：路力生，霍永庭，闫加庆，李艳敏，罗甜，芦迪，
申请(专利权)人：广东菲鹏制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：