一种枯草芽孢杆菌发酵产抗菌肽工艺及制备方法技术

本发明专利技术提供了一种枯草芽孢杆菌发酵产抗菌肽工艺及制备方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术以实验室筛选的能够代谢产生抗菌肽的枯草芽孢杆菌作为发酵生产菌株，通过液体种子制备、发酵液制备、发酵液预处理、抗菌肽分离纯化、抗菌肽分离纯化液浓缩、抗菌肽浓缩液真空冷冻干燥等工艺技术方法制备枯草芽孢杆菌抗菌肽。本发明专利技术工艺简单，抗菌肽抑菌活性高产量高、无毒副作用，可以用作食品防腐剂、饲料添加剂，具有无毒、无残留、不产生耐药性、安全性高等优点。等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌发酵产抗菌肽工艺及制备方法


[0001]本专利技术涉及生物发酵以及抗菌肽领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌发酵产抗菌肽工艺及制备方法。

技术介绍

[0002]由于抗生素的广泛应用，病原微生物对抗生素产生了抗性，致使超级细菌的出现，过去十年中新抗生素的发展步伐变慢，进一步加剧了当前的全球挑战。由于抗菌肽的长度、序列和结构复杂多样造就了它具有新颖独特的两亲性结构性质，加之具有抑菌谱广、低抗药性、热稳定性高和分子量小等功能，被视为抗生素的优良替代品。枯草芽孢杆菌代谢产生肽类抗生素，通常这些抗生素的肽链多呈闭合环状，几乎没有游离的氨基和羧基，不能被蛋白酶分解，活性肽稳定性较强。
[0003]抗菌肽是微生物细胞次级代谢产物，分子量在2000-7000Da左右，这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。与抗生素相比，抗菌肽安全性高，对人和动物正常细胞无害，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类生物防腐剂，在医药工业、食品工业以及饲料工业中有广阔的应用前景。
[0004]在食品防腐领域，我国与国际上一些发达国家相比技术上和普及方面还有不小的差距。传统的食品保鲜方法主要采用化学防腐剂或腌渍（糖、醋、盐等）、熏制、干燥等物理手段，但是这些会导致食品安全、品质及风味改变等问题。而天然防腐剂具有毒副作用小、可降解、使用安全等优点，渐渐有取代传统化学防腐剂的趋势。天然防腐剂的开发已经得到国内很多研究者的重视。在天然防腐剂中，抗菌肽类防腐剂由于其安全无毒害，甚至对人体有保健作用而受到人们的广泛关注，正在成为食品防腐保鲜领域的新宠。
[0005]随着经济的发展，人们生活水平的提高，食品安全问题越来越受到广泛关注，长期以来抗生素作为有害菌生长抑制剂在动物饲料及饲料添加剂中大量使用，久而久之抗生素耐药性及抗生素残留问题不断被暴露出来，目前人们对其使用所产生的副作用——药物残留、耐药性和环境污染等问题日益关注，抗生素在饲料业中已面临着被淘汰或禁用的局面，欧盟在2006年已经全面禁止将抗生素作为饲料添加剂用于饲料中。因此研制具有广谱、无毒、无公害、无残留的新型抗菌剂代替抗生素作饲料添加剂已成为当前国内外饲料科学研究的一项重要的内容。我国是畜禽产品生产的大国，但是，由于各方面的原因，我国目前尚未全面禁止饲用抗生素，而且目前我国生产的多数抗生素饲料添加剂为国外已淘汰或将被禁用的产品，如喳乙醇、阿散酸、杆菌肽锌、泰乐菌素、维吉尼亚霉素等，这严重影响了我国畜禽产品对外出口。据有关部门统计，我国每年因此损失达到上百亿美元，造成了巨大的经济损失，严重影响了我国畜牧业的发展，更为严重的是还损害了我国畜产品在国际上的声誉，面对全球研发环保型高效饲料添加剂的大潮，加快相关方面的研究已势在必行。
[0006]由于微生物生产抗菌肽有成本低、无毒害、周期短等明显优点，近年微生物生产抗菌肽的研究开始兴起，但当前研究主要集中在乳酸菌，而乳酸菌产生的抗菌肽存在着耐热性差、抗菌谱窄等问题，如何解决这些问题，还有待进一步研究，芽孢杆菌和类芽孢杆菌产
生的抗菌肽普遍抑菌谱广、稳定性高，引起广泛关注，目前对抗菌肽的提取多是从植物或者昆虫体内获取，而对芽抱杆菌发酵产生制备抗菌肽的的报道并不多，同时实现其产业化应用的则更加少之又少。

技术实现思路

[0007]为了解决现有技术中存在问题以及在枯草芽孢杆菌发酵生产抗菌肽中的不足，本专利技术提供一种枯草芽孢杆菌发酵产抗菌肽工艺及制备方法。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术提供的代谢产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株，所述菌株由公司研发中心进过长期分离纯化实验筛选制备，并命名为QR-KJ-092。
[0009]本专利技术所述菌株的主要生物学特征为：好氧菌，细胞大小(0.6μm～0.8μm)
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(1.8μm～2.5μm)，菌体呈杆状，菌体单个存在，无荚膜，周生硬毛、能运动的革兰氏阳性菌；菌落表面粗糙不透明；培养基上的菌落圆或者不规则形，表面色暗，变厚和不透明，有褶皱，菌落呈现奶油色或微黄色，发酵培养能够利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、淀粉、植物蛋白、动物源蛋白，能水解淀粉、色氨酸；生长温度范围35℃～55℃，最适温度为40℃。
[0010]同时本专利技术首先提供一种枯草芽孢杆菌保藏培养基及发酵培养基。
[0011]所述枯草芽孢杆菌保藏培养基由以下质量百分比成分组成：蔗糖2%、蛋白胨0.5%、牛肉浸膏1.5%、NaCl 0.1%、K2HPO
4 0.5%、琼脂2%，pH7.0。
[0012]所述枯草芽孢杆菌发酵培养基由以下质量百分比成分组成：葡萄糖10%、酵母浸膏0.75%、豆粕5%、玉米浆干粉1%、氯化钠0.15%、硫酸镁0.05%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸锰0.02%，调节发酵液pH7.0。
[0013]本专利技术同时还提供一种抗菌肽发酵生产方法，其发酵生产方法主要包含以下几个步骤：（1）产抗菌肽枯草芽孢杆菌菌株活化；（2）50L一级种子罐及500L二级种子罐制备；（3）5T发酵罐发酵培养，利用以上所述枯草芽孢杆菌发酵培养基培养枯草芽孢杆菌代谢产生抗菌肽。
[0014]所述步骤（1）所述产抗菌肽枯草芽孢杆菌菌株编号QR-KJ-092。
[0015]所述步骤（2）先用制备好的斜面母种，在无菌条件下接种，用接种环挑取两环于150mL三角瓶母种培养基中，在40℃，150r/min培养1.5d，制得一级三角瓶种子液；将一级种子液以2.5%的接种量（体积百分比），接种到5L种子液体培养基中，在40℃，150r/min培养1.5d，制得二级三角瓶种子液；将二级三角瓶种子液以2.5%（体积百分比）的接种量接种到50L液体种子罐培养基中，于42℃，罐压0.05MPa，通气量2.5m3/h条件下培养35h；将50L液体种子罐种子液以2.5%（体积百分比）的接种量接种到500L液体种子罐中，于42℃，罐压0.05MPa，通气量30m3/h条件下培养35h；所述步骤（3）将500L液体种子罐发酵种子液按照2.5%（体积百分比）的接种量接种到5T发酵罐中，于42℃，罐压0.05MPa，通气量50m3/h条件下培养35h。
[0016]（4）本专利技术还提供抗菌肽制备方法：a．发酵液的预处理，将步骤（3）发酵液采用GQ105管式离心机，设定转速16000r/min离
心，去除菌泥，收集上清液，即得含抗菌肽上清液；b．将步骤a得到的含抗菌肽上清液加入0.1mol/L的HCl溶液，将溶液pH调节至上清液大量出现沉淀，收集沉淀，去掉上清液；c．利用0.02mol/L的磷酸盐缓冲液溶解步骤b得到的含抗菌肽沉淀物质，得到初步处理的粗抗菌肽溶液；d．浓缩步骤c制备的粗抗菌肽溶液，利用截留分子量1000-2000Da的超滤膜浓缩粗抗菌肽溶液，过夜，弃滤液，得到浓缩液；e．25℃下向浓缩液中慢慢加入硫酸铵至10%饱和度，4℃静置2h，然后采用8500r/min离心10min，收集上清液，再向收集的上清液中加入硫酸铵至60%饱和度，4℃静置4h，12000r/min本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌发酵产抗菌肽工艺及制备方法，其特征在于包含以下技术步骤：（1）所述产抗菌肽枯草芽孢杆菌菌株编号QR-KJ-092；（2）先用制备好的斜面母种，在无菌条件下接种，用接种环挑取两环于150mL三角瓶母种培养基中，在40℃，150r/min培养1.5d，制得一级三角瓶种子液；（3）将一级种子液以2.5%的接种量（体积百分比），接接种到5L种子液体培养基中，在40℃，150r/min培养1.5d，制得二级三角瓶种子液；（4）将二级三角瓶种子液以2.5%（体积百分比）的接种量接种到50L液体种子罐培养基中，于42℃，罐压0.05MPa，通气量2.5m3/h条件下培养35h；（5）将50L液体种子罐种子液以2.5%（体积百分比）的接种量接种到500L液体种子罐中，于42℃，罐压0.05MPa，通气量30m3/h条件下培养35h；（6）所述步骤（5）将500L液体种子罐发酵种子液按照2.5%（体积百分比）的接种量接种到5T发酵罐中，于42℃，罐压0.05MPa，通气量50m3/h条件下培养35h；（7）发酵液的预处理，将步骤（3）发酵液采用GQ105管式离心机，设定转速16000r/min离心，去除菌泥，收集上清液，即得含抗菌肽上清液；（8）将抗菌肽上清液加入0.1mol/L的HCl溶液，将溶液pH调节至上清液大量出现沉淀，收集沉淀，去掉上清液；（9）利用0.02mol/L的磷酸盐缓冲液溶解得到的含抗菌肽沉淀物质，得到初步处理的粗抗菌肽溶液；（10）利用截留分子量1000-2000Da的超滤膜浓缩粗抗菌肽溶液，过夜，弃滤液，得到浓缩液；（11）25℃下向浓缩液中慢慢加入硫酸铵至10%饱和度，4℃静置2h，然后采用8500r/min离心10min，收集上清液，再向收集的上清液中加入硫酸铵至60%饱和度，4℃静置4h，12000r/min离心20min，收集沉淀，然后采用0.02...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙标，朱煜冬，赵迎庆，张富明，陈维菁，
申请(专利权)人：浙江启润生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：