一种抗LAG-3单克隆抗体的纯化方法技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体提供了一种抗LAG

【技术实现步骤摘要】
一种抗LAG
‑
3单克隆抗体的纯化方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，特别涉及一种抗LAG
‑
3单克隆抗体的纯化方法。

技术介绍

[0002]LAG
‑
3(淋巴细胞激活基因3，lymphocyte activation gene
‑
3，LAG
‑
3，CD223)是一种免疫检查点受体蛋白，它是免疫球蛋白家族中一个重要的负性共刺激分子，并且影响T细胞功能。正常情况下，LAG
‑
3主要通过与MHCII配体结合，介导负性信号，调节T细胞增殖和功能，维持机体T细胞的稳态。在肿瘤环境中，LAG
‑
3可通过抑制具有抗肿瘤活性的CD8+T细胞的增殖，直接影响其免疫功能。此外，LAG
‑
3表达聚集在肿瘤病灶的Treg细胞，抑制细胞毒性T细胞。因此，LAG
‑
3逐渐被认为是一个颇有潜力的免疫检查点受体，并且临床前证据表明针对该靶点的抗体药物将来有可能成为重要的抗肿瘤药物。
[0003]目前以LAG
‑
3为靶点的药物全球尚无上市，临床在研的药物有二十多个，面对激烈的竞争，产品质量及生产成本都成为市场的焦点。因此，抗LAG
‑
3单克隆抗体的制备生产过程越来越受到关注，其中纯化工艺尤为重要。
[0004]常规的抗体药物制备工艺主要包括抗体捕获和精制纯化两个阶段，由于细胞培养过程中，细胞分泌、破碎后产物复杂，一般采用三步层析法。发酵液上清经亲和层析粗纯后，料液成分仍较复杂，含聚体、宿主DNA、宿主细胞蛋白等多种杂质，一般还需经阴离子交换、阳离子交换层析和疏水作用层析进一步除杂。但每一步层析结束后均需通过换液或调整缓冲液来适应下一步的纯化条件，在批量生产中，过多的中间操作步骤很有可能面临新杂质引入的风险，同时生产时间较长，生产成本较高，同时还有可能影响回收率，此外，虽然层析过程中使用的蛋白A层析树脂用于捕获单克隆抗体时，可以清除大部分来自细胞培养液的杂质，但是仍有少量的一种或多种杂质由于与蛋白A树脂非特异结合而无法被清除，因此，急需开发一种能够专门适用于本专利技术提供的抗LAG
‑
3单克隆抗体的纯化方法。

技术实现思路

[0005]现有的纯化方法复杂，不仅延长了纯化时间，而且有可能面临新杂质引入的风险，影响回收率，同时还会增加成本，为此，本专利技术公开了一种抗LAG
‑
3单克隆抗体的纯化方法。
[0006]本专利技术具体技术方案如下：
[0007]本专利技术提供了一种抗LAG
‑
3单克隆抗体的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
[0008]S1、亲和层析：
[0009]S11、使用1
‑
5CV的缓冲液A对亲和层析柱进行平衡，所述亲和层析柱的介质包括MabSelect Sure、MabSelect Sure LX、MabSelect PrismA或Eshmuno A中的一种，所述缓冲液A包括Tris
‑
HCl缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液，所述缓冲液A的电导率为，15
‑
25mS/cm，且所述缓冲液A的pH为7
‑
8；
[0010]S12、将含有抗LAG
‑
3单克隆抗体的细胞上清液以100
‑
300cm/h的流速上样至所述亲和层析柱上，上样载量为20
‑
60mg蛋白/ml树脂，所述亲和层析柱的柱床高度为18
‑
22cm；
[0011]S13、上样结束后，使用所述缓冲液A进行再平衡，待紫外信号平稳后，使用1
‑
5CV的缓冲液B进行第一次的中间淋洗，直至紫外吸收值的曲线降至平稳后，停止冲洗，再使用2
‑
5CV的所述缓冲液A进行第二次淋洗，所述缓冲液B的浓度为30
‑
60mM，其pH为5
‑
9，；
[0012]S14、使用缓冲液C对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外吸收值上升至100mAU时，开始收集蛋白溶液，当所述紫外吸收值降至100mAU时结束收集，备用，所述缓冲液C的浓度为20
‑
200mM，其pH为3
‑
4；
[0013]S15、使用酸溶液将收集的所述蛋白溶液的pH值调节至3.5
‑
3.7，并在此pH条件下室温孵育0.5
‑
2.5h，最后用1M的Tris缓冲液将所述蛋白溶液的pH回调至5
‑
7；
[0014]S2、阴离子交换层析：
[0015]S21、使用3
‑
5CV的缓冲液D对阴离子交换层析柱进行平衡，待紫外吸收值、pH值和电导率的曲线同时降至平稳后，将亲和层析后的所述蛋白溶液以100
‑
200cm/h的流速上样至所述阴离子交换层析柱上，其上样载量为50
‑
150mg蛋白/ml树脂，所述阴离子交换层析柱的柱床高度为20
‑
24cm，所述缓冲液D的pH为5.0
‑
7.0；
[0016]S22、当所述蛋白溶液全部上样完成后，继续使用所述缓冲液D洗脱，待所述紫外吸收值上升至100mAU时，开始收集流穿液，直至紫外吸收值降到基线，结束收集。
[0017]本专利技术根据抗LAG
‑
3单克隆抗体的特点专门为其设计两步层析纯化方法，整个纯化方法的操作步骤简单，层析过程中无需使用过多的缓冲液冲洗，避免引入杂质，此外，在本专利技术中，步骤S13中，在蛋白溶液洗脱之前通过两次不同缓冲液的淋洗，能够去除与亲和层析柱介质非特异性结合的一种或多种HCPs杂质，避免了杂质与蛋白溶液共洗脱，本专利技术中通过洗脱、捕获之后的蛋白溶液可以直接用于后续纯化操作，无需蛋白溶液稀释、换液等预处理过程，大大节省了纯化时间，提高了回收率，节省了经济成本，能够适用于批量生产。
[0018]进一步的，步骤S1中，所述抗LAG
‑
3单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括3个重链互补决定区，3个所述重链互补决定区分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，所述轻链可变区包括3个轻链互补决定区，3个所述轻链互补决定区分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自以下任意一种：
[0019]A
‑
1:所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR1包含如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2包含如SEQ ID No:5所示的氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗LAG
‑
3单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括以下步骤：S1、亲和层析：S11、使用1
‑
5CV的缓冲液A对亲和层析柱进行平衡，所述亲和层析柱的介质包括MabSelect Sure、MabSelect Sure LX、MabSelect PrismA或Eshmuno A中的一种，所述缓冲液A包括Tris
‑
HCl缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液，所述缓冲液A的电导率为15
‑
25mS/cm，且所述缓冲液A的pH为7
‑
8；S12、将含有抗LAG
‑
3单克隆抗体的细胞上清液以100
‑
300cm/h的流速上样至所述亲和层析柱上，上样载量为20
‑
60mg蛋白/ml树脂，所述亲和层析柱的柱床高度为18
‑
22cm；S13、上样结束后，使用所述缓冲液A进行再平衡，待紫外信号平稳后，使用1
‑
5CV的缓冲液B进行第一次的中间淋洗，直至紫外吸收值的曲线降至平稳后，停止冲洗，再使用2
‑
5CV的所述缓冲液A进行第二次淋洗，所述缓冲液B的浓度为30
‑
60mM，其pH为5
‑
9；S14、使用缓冲液C对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外吸收值上升至100mAU时，开始收集蛋白溶液，当所述紫外吸收值降至100mAU时结束收集，备用，所述缓冲液C的浓度为20
‑
200mM，其pH为3
‑
4；S15、使用酸溶液将收集的所述蛋白溶液的pH值调节至3.5
‑
3.7，并在此pH条件下室温孵育0.5
‑
2.5h，最后用1M的Tris缓冲液将所述蛋白溶液的pH回调至5
‑
7；S2、阴离子交换层析：S21、使用3
‑
5CV的缓冲液D对阴离子交换层析柱进行平衡，待紫外吸收值、pH值和电导率的曲线同时降至平稳后，将亲和层析后的所述蛋白溶液以100
‑
200cm/h的流速上样至所述阴离子交换层析柱上，其上样载量为50
‑
150mg蛋白/ml树脂，所述阴离子交换层析柱的柱床高度为20
‑
24cm，所述缓冲液D的pH为5.0
‑
7.0；S22、当所述蛋白溶液全部上样完成后，继续使用所述缓冲液D洗脱，待所述紫外吸收值上升至100mAU时，开始收集流穿液，直至紫外吸收值降到基线，结束收集。2.如权利要求1所述的抗LAG
‑
3单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述抗LAG
‑
3单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括3个重链互补决定区，3个所述重链互补决定区分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，所述轻链可变区包括3个轻链互补决定区，3个所述轻链互补决定区分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自以下任意一种：A
‑
1:所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR1包含如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2包含如SEQ ID No:5所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列；A
‑
2：所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR1包含如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2包含如SEQ ID No:7所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如SEQ ID No:8所示的氨基酸序列；A
‑
3：所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:9所示的氨基酸序列，所述重链互补
决定区HCDR2包含如SEQ ID No:10所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:11所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR1包含如SEQ ID No:12所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2包含如SEQ ID No:13所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如SEQ ID No:14所示的氨基酸序列；A
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4：所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:15所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:16所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:17所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR1包含如SEQ ID No:18所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2包含如SEQ ID No:19所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如SEQ ID No:20所示的氨基酸序列。3.如权利要求2所述的抗LAG
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3单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述抗LAG
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3单克隆抗体为嵌合抗体分子，所述嵌合抗体分子包括鼠源抗体可变区和人源抗体恒定区，所述鼠源抗体可变区选自以下任意一种：MA
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1：所述重链可变区包含如SEQ ID No:21所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:22所示的氨基酸序列；MA
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2：所述重链可变区包含如SEQ ID No:21所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如...

【专利技术属性】
技术研发人员：白义，李春菊，孟艳敏，
申请(专利权)人：北京精益泰翔技术发展有限公司，
类型：发明
国别省市：