一种检测一种或多种聚合酶活性的方法技术

本发明专利技术利用熔解曲线分析，提供了一种检测一种或多种聚合酶活性的方法。本申请的方法能够粗略的且快速的判断聚合酶的活性，操作简便，步骤简单，也节省了检测时间。也节省了检测时间。也节省了检测时间。

【技术实现步骤摘要】
一种检测一种或多种聚合酶活性的方法


[0001]本专利技术利用熔解曲线分析，提供了一种检测一种或多种聚合酶活性的方法。

技术介绍

[0002]MMLV反转录酶基因，来源于小鼠白血病病毒(Molony Murine Leukemia Virus)基因组，MMLV常于作制备多个或多组合的突变体，可通过大规模测试筛选出高效率或具有其他生物学特性的逆转录酶。传统的技术可以较为准确测定逆转录酶的活性。例如，逆转录酶活性的检测方法一般为产物
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增强逆转录酶测定(PERT)和基于聚合酶链式反应的逆转录酶测定(PBRT)。但是，目前尚缺乏可以粗略判断逆转录酶活性的方法，如果能够较为快速简单地区分逆转录酶活性的高低，则可以提升效率。
[0003]本申请欲采用熔解曲线技术用于酶活性的判断，以解决传统方法的问题。熔解曲线是指随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。最初的熔解曲线使用嵌入式染料对产物进行定量，但这些染料存在重大缺点，即会同时检测特异性以及非特异性的核酸产物。通过引入荧光标记探针，熔解曲线得到了显著提升。这些荧光探针的使用，使得熔解曲线的方法得到了发展，实现了仅对特定核酸产物的检测。本专利技术对熔解曲线分析进行改良，创新性地实现了熔解曲线分析在逆转录酶活性测定中的应用。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本申请利用检测探针，对聚合酶扩增核酸分子的核酸产物进行熔解曲线分析，计算熔解峰峰高，实现了对一种或多种聚合酶的活性的检测。
[0005]因此，在第一方面，本申请提供了一种检测一种或多种聚合酶活性的方法，所述方法包括：
[0006](a)提供含有核酸分子的样品、引物组以及提供一种或多种待检测的聚合酶，所述引物组能够扩增所述核酸分子；
[0007](b)提供至少一条检测探针，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；在允许核酸杂交或退火的条件下，所述检测探针能够与所述核酸分子的指定区域特异性杂交；
[0008](c)使用所述聚合酶和引物组对所述核酸分子进行扩增，获得扩增产物，并且，使用所述检测探针对扩增产物分别进行熔解曲线分析；
[0009](d)根据步骤(c)的熔解曲线分析结果，获得扩增产物的熔解峰峰高(Rm)，从而分析一种或多种聚合酶的活性。
[0010]在某些实施方案中，其中，在步骤(c)中，将所述核酸分子与所述聚合酶和所述引物组混合，并进行扩增，然后，在扩增结束后，将检测探针加入到步骤(b)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(b)中，将所述核酸分子与所述聚合酶、所述引物组和所述检测
scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcus gorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium occultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus。
[0024]在某些实施方案中，所述聚合酶是DNA聚合酶，所述DNA聚合酶各自独立地选自Bst DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶，phi29 DNA聚合酶，T4 DNA聚合酶，T5 DNA聚合酶，Pfu DNA聚合酶，vent DNA聚合酶或其任何组合。
[0025]在某些实施方案中，所述聚合酶是DNA聚合酶，所述DNA聚合酶包括逆转录酶。
[0026]在某些实施方案中，所述聚合酶是逆转录酶，所述逆转录酶各自独立地选自MMLV逆转录酶，AMV逆转录酶，HIV逆转录酶，或其任何组合。
[0027]在某些实施方案中，其中，在所述方法的步骤(a)中，针对每一种核酸分子，提供至少一对引物组，所述引物组包含至少一条正向引物和至少一条反向引物。
[0028]在某些实施方案中，其中，所述正向引物和反向引物各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。
[0029]在某些实施方案中，其中，在所述方法的步骤(b)中，针对每一种扩增产物，提供至少一条检测探针(例如，提供1条，2条，3条，4条，5条，6条，7条，8条，9条，10条，或更多条检测探针)。
[0030]在某些实施方案中，每一条检测探针与所述扩增产物所形成的双链杂交体之间具有不同的熔点(T
m
)；在某些实施方案中，所述检测探针与所述核酸分子的扩增产物所形成的双链杂交体之间的熔点(T
m
)相差1℃(例如，1℃，2℃，3℃)以上。
[0031]在某些实施方案中，所述检测探针各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成。
[0032]在某些实施方案中，所述检测探针的长度各自独立地为15
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1000nt，例如15
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20nt，20
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30nt，30
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40nt，40
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50nt，50
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60nt，60
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70nt，70
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80nt，80
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90nt，90
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100nt，100
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200nt，200
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300nt，300
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400nt，400
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500nt，500
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600nt，600
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700nt，700
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800nt，800
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900nt，900
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1000nt。
[0033]在某些实施方案中，所述检测探针各自独立地具有3'
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OH末端；或者，所述检测探针的3'
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末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'
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OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'
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OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'
‑
末端。
[0034]在某些实施方案中，在步骤(d)中，对步骤(c)的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测一种或多种聚合酶活性的方法，所述方法包括：(a)提供含有核酸分子的样品、引物组以及提供一种或多种待检测的聚合酶，所述引物组能够扩增所述核酸分子；(b)提供至少一条检测探针，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；在允许核酸杂交或退火的条件下，所述检测探针能够与所述核酸分子的指定区域特异性杂交；(c)使用所述聚合酶和引物组对所述核酸分子进行扩增，获得扩增产物，并且，使用所述检测探针对扩增产物分别进行熔解曲线分析；(d)根据步骤(c)的熔解曲线分析结果，获得扩增产物的熔解峰峰高(Rm)，从而分析一种或多种聚合酶的活性。2.权利要求1的方法，其中，在步骤(c)中，将所述核酸分子与所述聚合酶和所述引物组混合，并进行扩增，然后，在扩增结束后，将检测探针加入到步骤(b)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(b)中，将所述核酸分子与所述聚合酶、所述引物组和所述检测探针混合，并进行扩增，然后，在扩增结束后，进行熔解曲线分析。3.权利要求1或2的方法，所述方法具有以下的一种或多种特征：(1)在步骤(d)中，通过比较多种待测聚合酶的扩增产物的熔解峰峰高(Rm)，从而分析多种聚合酶的活性；(2)在步骤(a)中，提供1种，2种，3种，4种，5种，6种，7种，8种，9种，10种，20种，30种，40种，50种，或更多种聚合酶；(3)在步骤(d)中，通过实时荧光PCR仪获得熔解峰峰高(Rm)，或者对熔解曲线的原始数据(例如，T
m
值，对应荧光通道的荧光信号值)进行计算获得熔解峰峰高(Rm)。4.权利要求1
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3任一项所述的方法，在所述方法的步骤(a)或(b)中，还提供脱氧核苷三磷酸(dNTPs)，水，包含离子(例如Mg
2+
)的溶液，单链DNA结合蛋白，或其任何组合。5.权利要求1
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4任一项所述的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)所述样品包含或是DNA，RNA，或其任何组合；(2)所述核酸分子选自DNA，RNA，或其任何组合；(3)所述扩增产物选自DNA，RNA，或其任何组合；优选地，所述扩增产物为RNA；(4)所述样品来源于真核生物(例如，动物，植物，真菌)，原核生物(例如，细菌，放线菌)，病毒，噬菌体，或其任何组合。6.权利要求1
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5任一项所述的方法，其中，所述聚合酶具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)所述聚合酶各自独立地选自DNA聚合酶，RNA聚合酶，或其任何组合；(2)所述聚合酶是DNA聚合酶，所述DNA聚合酶各自独立地获自选自下列的细菌：Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,
Thermus oshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcus gorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium occultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus；(3)所述聚合酶是DNA聚合酶，所述DNA聚合酶各自独立地选自Bst DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶，phi29 DNA聚合酶，T4 DNA聚合酶，T5 DNA聚合酶，Pfu DNA聚合酶，vent DNA聚合酶或其任何组合；(4)所述聚合酶是DNA聚合酶，所述DNA聚合酶包括逆转录酶；(5)所述聚合酶是逆转录酶，所述逆转录酶各自独立地选自MMLV逆转录酶，AMV逆转录酶，HIV逆转录酶，或其任何组合。7.权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：倪润芳，黄丽婷，邱逸东，何昌华，宋娜杰，
申请(专利权)人：厦门致善生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：