重组载体及其在构建糖尿病视网膜病变小鼠模型中的应用制造技术

本发明专利技术属于动物模型技术领域，具体涉及重组载体及其在构建糖尿病视网膜病变小鼠模型中的应用。所述重组载体是将SEQ ID NO.1第9

【技术实现步骤摘要】
重组载体及其在构建糖尿病视网膜病变小鼠模型中的应用


[0001]本专利技术属于动物模型
，具体涉及重组载体及其在构建糖尿病视网膜病变小鼠模型中的应用。

技术介绍

[0002]近年来，糖尿病(DM)的发病率持续增加，严重影响人们的生活与健康。糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病微血管并发症，也是导致患者视力障碍或失明的重要原因。长期高血糖是DR患者发病的直接因素，最终导致患者微血管和视网膜损伤，甚至失明。根据病理变化，DR发展阶段包括非增殖性糖尿病视网膜病变(NPDR)和增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)。NPDR始于微血管病变，包括周细胞损失与内皮细胞损伤，血视网膜屏障的血管通透性增加，糖尿病性黄斑水肿、微动脉瘤、斑点状出血和棉绒斑。NPDR可进一步发展为PDR，且发病率随着病程的增加而增加。未治疗的PDR的并发症有玻璃体出血和牵拉性视网膜脱离。所以PDR是引起DR患者视网膜功能障碍的主要因素。
[0003]治疗DR主要取决于对糖尿病黄斑水肿和新生血管阶段的治疗。DR中抗血管内皮生长因子(VEGF)的发现是临床一个里程碑式的进展。目前，抗VEGF和糖皮质激素是DR并发症的主要治疗方法。然而，大部分的糖尿病黄斑水肿患者对这些单一疗法具有抗药性，而一小部分患者对双重疗法也具有抗药性，从而导致视力下降。因此，DR的治疗急需一种新疗法，最终逆转疾病进程。而动物模型为DR的研究和开发新一代眼科疗法提供了手段。
[0004]动物模型在DR的病理生理学、进展和病因学的研究中有至关重要的作用。啮齿动物成本低、寿命短、繁殖速度快，是DR动物模型中应用最广泛的。犬类DR的表型与人类DR非常相似，然而，伦理问题和成本效率阻碍其广泛应用。相比其他动物，大小鼠比较易于表现DR的发病机制。目前，有几种方法可诱导不同阶段的DR，包括药物诱导、基因编辑、环境暴露和外科手术等方法。在1型糖尿病(T1DM)中，DR的药理学诱导是通过四氧嘧啶或抗生素链脲佐菌素(STZ)给药破坏胰腺实现的。由于STZ显型速度更快，是诱导DR的首选药物。然而，STZ诱导的DR模型很少发生PDR。所以，目前还未有动物模型可完全模拟人DR的整个发病进程。
[0005]因此，急需开发一种新的DR高阶动物模型可模拟人类糖尿病视网膜病变。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于弥补现有技术的空白，提供重组载体及其在构建糖尿病视网膜病变小鼠模型中的应用。
[0007]第一方面，本专利技术提供一种重组载体，是将SEQ ID NO.1第9
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492位所示DNA序列插入pAV
‑
CMV
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GFP
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miRNA载体的AsisI和MluI位点之间获得的。
[0008]第二方面，本专利技术提供含有所述重组载体的重组病毒。
[0009]第三方面，本专利技术提供所述重组病毒的构建方法，是将包装质粒、辅助质粒和所述重组载体共转染至HEK
‑
293T细胞，培养72h后收集病毒，得到所述重组病毒。
[0010]第四方面，本专利技术提供所述重组病毒在构建糖尿病视网膜病变小鼠模型中的应
用。
[0011]第五方面，本专利技术提供一种构建糖尿病视网膜病变小鼠模型的方法，包括以下步骤：
[0012]给小鼠注射浓度为10mg/ml的STZ溶液，注射后持续高脂高糖高胆固醇喂食，然后玻璃体腔注射所述重组病毒，一个月后，再注射一次，得到所述糖尿病视网膜病变小鼠模型。
[0013]进一步的，所述小鼠为8周龄的雄性小鼠。
[0014]更进一步的，所述STZ溶液的配制方法包括：将STZ溶于0.1mmol/L的枸橼酸
‑
枸橼酸钠缓冲液中，并加入0.1mol/L的NaOH溶液调至pH为4.5，使STZ最终浓度为10mg/ml，然后用0.2um的微孔过滤器过滤除菌。
[0015]更进一步的，所述小鼠注射STZ溶液的剂量为70
‑
75mg/kg，连续注射3天。
[0016]更进一步的，所述重组病毒的滴度为4.72
×
10
12
vg/ml。
[0017]更进一步的，小鼠每只眼睛注射所述重组病毒的剂量为1
‑
2μL。
[0018]本专利技术具有如下有益效果：
[0019]以往用于小鼠模型构建多是STZ诱导，该模型的缺点是成模率较低，有视网膜渗出及微血管瘤，但实验周期长，动物生命周期短，血管病变不典型，无新生血管。本专利技术建立的动物模型，可形成PDR的病理改变，能够模拟DR的疾病进程及PDR的相应表型，其自带荧光，易于观察视网膜病变，成模周期较短，动物成活率高，且寿命较长。
[0020]本专利技术为DR的研究补充了一种新的可视化工具，为筛选治疗DR的药物提供了新的平台。
附图说明
[0021]图1为pAV
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CMV
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GFP
‑
miRNA载体的质粒图谱。
[0022]图2为是正常组(A)、STZ组(B)、STZ+rAAV8
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SCR组(C)和STZ+rAAV8
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pri
‑
miR
‑
25组(D)，小鼠注射病毒2个月后眼底照相结果。
[0023]图3为正常组、STZ组、STZ+rAAV8
‑
SCR组和STZ+rAAV8
‑
pri
‑
miR
‑
25组，小鼠注射病毒2个月后OCT结果(A)和对应的眼底照相结果(B)。
[0024]图4为正常组(A)、STZ组(B)、STZ+rAAV8
‑
SCR组(C)和STZ+rAAV8
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pri
‑
miR
‑
25组(D)，小鼠注射病毒2个月后眼底FFA结果。
[0025]图5为正常组(A)、STZ组(B)、STZ+rAAV8
‑
SCR组(C)和STZ+rAAV8
‑
pri
‑
miR
‑
25组(E)(标尺＝20μm)，小鼠注射病毒2个月后视网膜铺片结果，图D为带有GFP标签的rAAV8
‑
pri
‑
miR
‑
25病毒表达定位图，图F为图D和图E的融合图。
[0026]图6为正常组(A)、STZ组(B)、STZ+rAAV8
‑
SCR组(C)和STZ+rAAV8
‑
pri
‑
miR
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25组(E)(标尺＝20μm)，小鼠注射病毒2个月后视网膜血管渗透结果，图D为带有GFP标签的rAAV8
‑
pri
‑
miR
‑
25病毒表达定位图，图F为图D和图E的融合图。。
具体实施方式本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组载体，其特征在于，是将SEQ ID NO.1第9
‑
492位所示DNA序列插入pAV
‑
CMV
‑
GFP
‑
miRNA载体的AsisI和MluI位点之间获得的。2.含有权利要求1所述重组载体的重组病毒。3.权利要求2所述重组病毒的构建方法，其特征在于，是将包装质粒、辅助质粒和所述重组载体共转染至HEK
‑
293T细胞，培养72h后收集病毒，得到所述重组病毒。4.权利要求2所述重组病毒在构建糖尿病视网膜病变小鼠模型中的应用。5.一种构建糖尿病视网膜病变小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：给小鼠注射浓度为10mg/ml的STZ溶液，注射后持续高脂高糖高胆固醇喂食，然后玻璃体腔注射权利要求2所述重组病毒，一个月后，再注射一次，第一次病毒注射两个月后得到所述糖尿病...

【专利技术属性】
技术研发人员：王艳歌，肖二卫，李苗，王刚，史平玲，宋宗明，陶冶，但汉东，张贝贝，杜恩明，魏圆梦，王娇娇，李晓丽，唐贺，黄子旭，
申请(专利权)人：河南省人民医院，
类型：发明
国别省市：