一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基及其应用制造技术

本发明专利技术涉及病毒繁殖技术领域，尤其涉及一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基及其应用，本发明专利技术的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，包括以下重量份原料：DMEM培养基85

【技术实现步骤摘要】
一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基及其应用


[0001]本专利技术涉及病毒繁殖
，尤其涉及一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基及其应用。

技术介绍

[0002]猪圆环病毒2型(PCV2)属于圆环病毒科，感染PCV2后导致母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎、猪皮炎、肾病综合征(PDNS)、断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)以及猪的先天性震颤等疾病。该病毒在全国各地区广泛流行，给世界养猪业带来了巨大的影响和严重的经济损失，现在对于猪圆环病毒2型主要以疫苗预防为主。目前疫苗生产中，常用PK
‑
15细胞增殖PCV2,但由于PCV2体外增殖能力弱,致使PCV2抗原含量较低,因此,PCV2的抗原含量高低已成为制约现有疫苗质量的关键瓶颈之一。
[0003]大规模细胞培养核心技术是提升单位体积内PK
‑
15细胞的数量,其中微载体悬浮培养、片状载体悬浮培养、全悬浮培养是当前较为成熟的一项大规模细胞培养技术，在国内外已成功应用于兽用疫苗抗原制备，这三种培养技术具有自动化控制程度高、不易污染、易于大规模生产、抗原产量和含量高等优点，其中，片状载体悬浮培养在单位体积内细胞的数量要大于微载体悬浮培养。而现有的片状载体，大多采用聚丙烯或聚酯无纺布制成，病毒附着率有待提升。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的是提供一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基及其应用，不仅能够为细胞繁殖培养提供营养物质，同时能够调整培养基贴壁因子，使得细胞适应悬浮培养，培养出免疫原性良好的圆环病毒。
[0005]本专利技术通过以下技术手段解决上述技术问题：
[0006]一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，包括以下重量份原料：DMEM培养基85
‑
95份、片状载体2
‑
5份、微量元素10
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20份、维生素0.5
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2份、氨基酸1
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3份，所述片状载体是以改性载体纤维经过压合、剪切制成，所述改性载体纤维为葛根纤维经过聚乙二醇改性而得。
[0007]本专利技术的悬浮培养基，改性载体纤维为原料制备得到片状载体，其中，葛根中的多糖类物质能够促进细胞的活性，使得细胞适应悬浮培养，而加入的改性载体纤维，其不仅能够作为微生物的载体物质，为细胞的繁殖提供营养物质，同时通过在葛根纤维中引入聚乙二醇，从而使得葛根纤维具有两亲性，不仅能够使得其更好的分散在水中，减少团聚，葛根纤维中的物质还具有一定的成膜性和粘附性，能够调整贴壁因子，也有利于细胞在片状载体表面的粘附，培养免疫原性良好的圆环病毒。
[0008]进一步，包括以下重量份原料：DMEM培养基90份、片状载体3份、微量元素12份、维生素1份、氨基酸2份。
[0009]进一步，所述微量元素包括：250
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300mg/L氯化钾、1500
‑
2000mg/L碳酸氢钠、0.03
‑
0.2mg/L硫酸铜、50
‑
60mg/L硫酸镁、1
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1.5mg/L氯化铁。
[0010]进一步，所述维生素包括：2
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4mg/L叶酸、6
‑
10mg/L烟酰胺、10
‑
15mg/L维生素C、50
‑
65mg/L氯化胆碱。
[0011]进一步，所述氨基酸包括：200
‑
220mg/L谷氨酸、300
‑
350mg/L脯氨酸、160
‑
180mg/L胱氨酸、300
‑
320mg/L络氨酸、400
‑
460mg/L丝氨酸、800
‑
900mg/L天冬氨酸。
[0012]进一步，所述片状载体的制备方法为：取制备得到的改性载体纤维，加入乙醇溶液中，再加入硅烷偶联剂，搅拌混合均匀，加入十二烷基磺酸钠，持续搅拌，升温至70
‑
80℃，保温反应10
‑
12h，反应完成后，冷却至室温，压滤，得到滤饼于40
‑
45℃温度下烘干，剪切、破碎得到片状载体。
[0013]进一步，所述改性载体纤维的制备方法包括以下步骤：
[0014]所述改性载体纤维的制备方法包括以下步骤：
[0015]S1：取葛渣，清洗去除杂质后加入复合酶，于50
‑
60℃温度下进行酶解处理1
‑
1.5h，反应完成后过滤，滤饼抖散、烘干得到葛根粗纤维；
[0016]S2：将制备得到的葛根粗纤维搅拌分散于硝酸钙溶液中，得到混悬液，将混悬液于70
‑
75MPa压力下进行高压匀质3次，旋转蒸干得到反应产物置于管式炉中，在氮气气氛下，升温至600
‑
650℃温度下煅1
‑
2h，煅烧完成后随炉冷却，取出喷洒加入去离子水，静置20min，浸泡于去离子水中，超声振荡洗涤，过滤、烘干得到葛根纤维；
[0017]S3：分别称取巯基乙酸和聚乙二醇加入甲苯中，搅拌混匀后加入对甲苯磺酸，然后在氮气气氛下搅拌升温至100
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120℃，保温反应12
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14h，得到反应产物用乙醚沉淀，过滤，滤饼烘干后加入N，N
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二甲基甲酰胺中，搅拌溶解后，加入2,4
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二异氰酸酯，然后加入葛根纤维，在氮气气氛下，升温至70
‑
80℃，保温反应150
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180min，反应完成后趁热过滤，滤饼用无水乙醇浸泡洗涤，再用去离子水透析3d，干燥得到改性载体纤维。
[0018]本专利技术的改性载体纤维，利用葛渣为原料，在复合酶的作用下，对葛根纤维的木质素、纤维素等进行分解，使得葛根纤维进行帚化疏解，提高葛根纤维的蓬松度和柔软度，然后再将其置于硝酸钙溶液中，吸附负载硝酸钙后通过煅烧，一方面实现对葛根纤维的部分碳化，使得葛根纤维表面变得粗糙有利于微生物的负载，另一方面硝酸钙经过煅烧形成氧化钙，在煅烧完成后喷洒的去离子水和纤维上的氧化钙反应，产生碱性的请氧化钙并产热，对葛根纤维进行活化，有利于后续的聚乙二醇的改性。
[0019]进一步，所述S1步骤的复合酶为α
‑
淀粉酶和纤维素酶的复合物，所述α
‑
淀粉酶和纤维素酶的质量比为1:(2
‑
5)。
[0020]此外，本专利技术还公开了上述的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基的应用，将培养基应用于猪圆环病毒2型的培养中。
[0021]本专利技术的有益效果：
[0022]本专利技术的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，通过对原料成分的调整，能够促进细胞活性，同时以改性葛根纤维为原料，制备得到片状载体，不仅能够为细胞繁殖培养提供营养物质，同时能够调整培养基贴壁因子，提高细胞在片状载体上的负载性，有利于提高细胞浓度，培养免疫原性良好的圆环病本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，其特征在于，包括以下重量份原料：DMEM培养基85
‑
95份、片状载体2
‑
5份、微量元素10
‑
20份、维生素0.5
‑
2份、氨基酸1
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3份，所述片状载体是以改性载体纤维经过压合、剪切制成，所述改性载体纤维为葛根纤维经过聚乙二醇改性而得。2.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，其特征在于，包括以下重量份原料：DMEM培养基90份、片状载体3份、微量元素12份、维生素1份、氨基酸2份。3.根据权利要求2所述的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，其特征在于，所述微量元素包括：250
‑
300mg/L氯化钾、1500
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2000mg/L碳酸氢钠、0.03
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0.2mg/L硫酸铜、50
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60mg/L硫酸镁、1
‑
1.5mg/L氯化铁。4.根据权利要求3所述的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，其特征在于，所述维生素包括：2
‑
4mg/L叶酸、6
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10mg/L烟酰胺、10
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15mg/L维生素C、50
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65mg/L氯化胆碱。5.根据权利要求4所述的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，其特征在于，所述氨基酸包括：200
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220mg/L谷氨酸、300
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350mg/L脯氨酸、160
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180mg/L胱氨酸、300
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320mg/L络氨酸、400
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460mg/L丝氨酸、800
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900mg/L天冬氨酸。6.根据权利要求1
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5所述的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，其特征在于，所述片状载体的制备方法为：取制备得到的改性载体纤维，加入乙醇溶液中，再加入硅烷偶联剂，搅拌混合均匀，加入十二烷基磺酸钠，持续搅拌，升...

【专利技术属性】
技术研发人员：项伟，沈建军，陈雪，张秀文，王悦芸，彭俊平，胡永明，娄坤鹏，李阳，
申请(专利权)人：浙江美保龙生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：