一种同步纯化脂肪酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的方法技术

本发明专利技术涉及蛋白纯化技术领域，且公开了一种同步纯化脂肪酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的方法，该方法采用硫酸铵盐析以及Q Beads 6FF阴离子层析来进行三种蛋白的纯化，该蛋白纯化技术通过下述步骤进行：通过硫酸铵盐析的方法确定三种蛋白析出时所对应的硫酸铵饱和度；将50％硫酸铵盐析出的蛋白与50％硫酸铵除杂后补至80％硫酸铵盐析出的蛋白分别上柱于QBeads 6FF阴离子交换柱，再用50

【技术实现步骤摘要】
一种同步纯化脂肪酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的方法


[0001]本专利技术涉及蛋白纯化
，具体为一种同步纯化脂肪酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的方法。

技术介绍

[0002]脂肪酶，是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于能源、油脂加工、食品、医药等行业领域。自然界中，脂肪酶普遍存在于植物种子、动物组织及微生物中，其中工业用脂肪酶多源于微生物。因其反应所需条件温和，催化率高，立体选择性好，广泛的底物特异性以及便于提取与潜在的无限供给，所以得到广大工业领域的普遍使用。
[0003]在当今社会，由于食品工业的迅猛发展，消费者的食品安全和健康意识日益增强，对面粉及豆制品的要求越来越高。若想生产好的面粉，就要有优质的原材料,所以需要在食品处理中添加催化酶，酶的催化效率特别高，比普通催化剂高出100倍以上，它不仅能提高面包的烘焙品质，还可以延长制品的保质期。
[0004]蛋白酶是可以水解蛋白中的肽键并生成氨基酸或小肽的一类酶，是世界三大酶制剂之一，占全球酶制剂销量的60％，其主要来源于动物、植物和微生物，一般情况下不含有毒有害物质，而且水解反应完全后自身可以被灭活，因此在食品工业中有着广泛的应用。其中酸性蛋白酶是一种适合于在酸性环境下水解蛋白质的酶类，它主要用于毛皮软化和脱毛处理，也可用于羊毛低温染色和啤酒澄清工艺，以及消炎止咳，化痰和助消化。在啤酒澄清过程中需要添加蛋白酶来降解啤酒中的悬浮物，以提高啤酒的澄清度，另外还可以提高底物的利用率，降低成本。
[0005]本专利技术对脂肪酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶的分离纯化进行了研究，提供了一种能够同步纯化脂肪酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶三种蛋白的方法，操作简便，纯化步骤较少，但纯化效果相对较好。此专利技术在各文献，专利中鲜有报道，有一定创新性并具有良好的工业应用前景。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种同步纯化脂肪酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的方法，该方法采用硫酸铵盐析以及Q Beads 6FF阴离子层析来进行三种蛋白的纯化，该蛋白纯化技术通过下述步骤进行：
[0007]步骤一、通过硫酸铵盐析的方法确定三种蛋白析出时所对应的硫酸铵饱和度；
[0008]步骤二、将50％硫酸铵盐析出的蛋白与50％硫酸铵除杂后补至80％硫酸铵盐析出的蛋白分别上柱于Q Beads 6FF阴离子交换柱，再用50
‑
400mM的NaCl溶液洗脱，收集各组分的洗脱液，进行蛋白浓度和酶活的测定；
[0009]步骤三、将收集好的酶液进行SDS
‑
PAGE电泳确定三种蛋白的纯化效果。
[0010]优选的，步骤一中需要配制40
‑
80％不同饱和度的硫酸铵沉淀蛋白，盐析后的酶液
需进行透析除盐。
[0011]优选的，步骤二中NaCl溶液需用溶解不同蛋白时所对应的缓冲液配制，上柱前需经0.45μm滤膜过滤。
[0012]优选的，步骤二中洗脱过程中流速控制在1mL/min，收集后的洗脱液需经浓缩后进行SDS
‑
PAGE电泳检测。
[0013]与现有技术对比，本专利技术具备以下有益效果：本专利技术同步纯化脂肪酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的方法，操作简便易懂，纯化步骤相对较少，最终使得脂肪酶纯化倍数提高63.24倍，酸性蛋白酶10.33倍，碱性蛋白酶31.69倍。
附图说明
[0014]通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0015]图1为硫酸铵分级盐析图；
[0016]图2为粗酶液电泳图；
[0017]图3为不同饱和度硫酸铵盐析电泳图；
[0018]图4为脂肪酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶三种蛋白纯化后的电泳图。
具体实施方式
[0019]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。附图仅用于示例性说明，表示的仅是示意图，而非实物图，不能理解为对本专利的限制，为了更好地说明本专利技术的具体实施方式，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸，对本领域技术人员来说，附图中某些公知结构、部件及其说明可能省略是可以理解的，基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0020]在本专利技术的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“连接”应做广义理解，例如可以是固定连接，可以是活动连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接，可以是机械连接，也可以是电连接，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本专利技术中的具体含义。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
[0021]请参阅图1
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4，一种同步纯化脂肪酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的方法，该方法采用硫酸铵盐析以及Q Beads 6FF阴离子层析来进行三种蛋白的纯化，该蛋白纯化技术通过下述步骤进行：
[0022]步骤一、通过硫酸铵盐析的方法确定三种蛋白析出时所对应的硫酸铵饱和度；
[0023]步骤二、将50％硫酸铵盐析出的蛋白与50％硫酸铵除杂后补至80％硫酸铵盐析出的蛋白分别上柱于Q Beads 6FF阴离子交换柱，再用50
‑
400mM的NaCl溶液洗脱，收集各组分的洗脱液，进行蛋白浓度和酶活的测定；
[0024]步骤三、将收集好的酶液进行SDS
‑
PAGE电泳确定三种蛋白的纯化效果。
[0025]其中，步骤一中需要配制40
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80％不同饱和度的硫酸铵沉淀蛋白，盐析后的酶液需
进行透析除盐。
[0026]其中，步骤二中NaCl溶液需用溶解不同蛋白时所对应的缓冲液配制，上柱前需经0.45μm滤膜过滤。
[0027]其中，步骤二中洗脱过程中流速控制在1mL/min，收集后的洗脱液需经浓缩后进行SDS
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PAGE电泳检测。
[0028]本专利技术采用硫酸铵盐析以及Q Beads 6FF阴离子层析来进行三种蛋白的纯化。该蛋白纯化技术通过下述步骤进行：(1)将酶粉：缓冲液按照1:10的比例进行稀释，混匀后8,000rpm离心5min，在上清中加入已研磨碎的硫酸铵粉末，静置3h后，8,000rpm再次离心5min，梯度盐析，最后收集各梯度的上清和沉淀放入透析袋中除盐。
[0029]将5倍柱体积盐析后的酶液上样于Q柱，流速为1mL/min(上样前酶液需经0.22μm滤头过滤除杂)。
[0030]配制50
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400mM的NaCl溶液，按照5倍柱体积梯度洗脱Q柱，收集各梯度的洗脱液，浓缩后进行酶活与蛋白测定。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同步纯化脂肪酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的方法，该方法采用硫酸铵盐析以及Q Beads 6FF阴离子层析来进行三种蛋白的纯化，其特征在于，该蛋白纯化技术通过下述步骤进行：步骤一、通过硫酸铵盐析的方法确定三种蛋白析出时所对应的硫酸铵饱和度；步骤二、将50％硫酸铵盐析出的蛋白与50％硫酸铵除杂后补至80％硫酸铵盐析出的蛋白分别上柱于Q Beads 6FF阴离子交换柱，再用50
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400mM的NaCl溶液洗脱，收集各组分的洗脱液，进行蛋白浓度和酶活的测定；步骤三、将收集好的酶液进行SDS
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PAGE电泳确定三种蛋白的纯化效果。2.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘影，包洲，刘钟文，
申请(专利权)人：江苏悠恒生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：