具有改进的特性的ω-羟化酶相关的融合多肽制造技术

本公开涉及ω

【技术实现步骤摘要】
具有改进的特性的
ω
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羟化酶相关的融合多肽
[0001]本申请是CN201580032792.3的分案申请。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求2014年6月16日提交的美国临时申请号62/012,970的权益，该案的完整公开内容以引用的方式在此并入。
[0004]序列表
[0005]本申请含有已经以ASCII格式用电子方式递交并且以整体引用的方式在此并入的序列表。在2015年6月16日创建的所述ASCII拷贝命名为LS00054PCT_SL.txt并且大小为484,554字节。
[0006]领域
[0007]本公开涉及ω
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羟化酶相关的融合多肽，所述多肽当在重组宿主细胞中表达时引起改进的ω
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羟基化脂肪酸衍生物产生。本公开进一步涉及用于表达用来产生ω
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羟基化脂肪酸衍生物的ω
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羟化酶相关的融合多肽的微生物。
[0008]背景
[0009]细胞色素P450单加氧酶(P450)是一组多种多样的酶。其被分类为家族和子家族。当其共享大于或等于百分之四十的氨基酸同一性时，其属于同一家族。当其共享大于或等于百分之五十五的氨基酸同一性时，其属于同一子家族。P450使用脂肪酸作为底物并且催化羟基化反应。细菌具有牵涉于烷烃降解和脂肪酸修饰中的数种P450系统并且迄今已知超过1000种微生物P450。一种特定P450子家族被称作cyp153A，其中最初在2001年从乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)克隆。其后，已经在如鞘氨醇单胞菌属种(Sphingomonas sp.)HXN200、分支杆菌属种(Mycobacterium sp.)HXN1500和博克岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis)的其它烷烃利用物种中鉴定出相似的酶(Van Bogaert等人(2011)FEBS Journal 278:206
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221)。来自细菌CYP153A子家族的数种P450为具有高末端区域选择性的烷烃ω
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羟化酶(ω
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羟化酶，还称作ω
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加氧酶)。CYP153A也已经与工业上相关的ω
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羟基化(ω
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羟基化)脂肪族化合物的合成相关，所述脂肪族化合物如伯醇、ω
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羟基化脂肪酸和双官能脂肪酸衍生物(如α,ω
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二羧酸和α,ω
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二醇)(Honda Malca等人(2012)Chem.Commun.48:5115
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5117)。
[0010]概述
[0011]本公开提供可在宿主细胞中产生ω
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羟基化
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和双官能脂肪酸衍生物的ω
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羟化酶相关的融合多肽和其变体。更具体说来，本公开提供CYP153A
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还原酶杂合融合多肽变体，所述变体产生ω
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羟基化
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(ω
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羟基化)和双官能脂肪酸衍生物和其组合物，包括ω
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羟基化脂肪酸、ω
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羟基化脂肪酯、α,ω
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二酸、α,ω
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二酯、α,ω
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二醇和由其衍生的化学品(如大环内酯)。还提供特异性CYP153A
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还原酶杂合融合核酸和蛋白质序列以及包含此类工程改造的CYP153A
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还原酶杂合融合多肽变体的重组宿主细胞和细胞培养物。本公开还提供使用表达重组CYP153A
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还原酶杂合融合多肽变体的宿主细胞以便制备ω
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羟基化和/或双官能脂肪酸衍生物或其组合物的方法。
[0012]本公开的一方面提供催化脂肪酸转化为ω
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羟基化(ω
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OH)脂肪酸或脂肪酸衍生
物的CYP153A
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还原酶杂合融合多肽，其中所述CYP153A
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还原酶杂合融合多肽与多肽序列SEQ ID NO:6具有至少约90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。进一步包括用于表达CYP153A
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还原酶杂合融合多肽和其变体的方法。一方面，所述CYP153A
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还原酶杂合融合多肽与SEQ ID NO:6具有至少90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性并且如与由野生型CYP153A的表达产生的效价相比，所述CYP153A
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还原酶杂合融合多肽在重组宿主细胞中的表达引起ω
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OH脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合物的更高效价。一方面，所述重组宿主细胞当在含有碳源的培养基中在有效表达所述CYP153A
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还原酶杂合融合多肽的条件下培养时产生ω
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OH脂肪酸或ω
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OH脂肪酸衍生物或其组合物，其具有比由表达相应野生型CYP153A的宿主细胞产生的ω
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OH脂肪酸或ω
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OH脂肪酸衍生物或其组合物的效价大至少约10％的效价。另一方面，所述ω
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OH脂肪酸或ω
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OH脂肪酸衍生物或其组合物在细胞外产生。
[0013]本公开的另一方面提供一种CYP153A
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还原酶杂合融合多肽变体，其与SEQ ID NO:6具有至少约90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且在包括位置796、141、231、27、82、178、309、407、415、516和/或666的氨基酸位置处具有至少一个突变，其中所述CYP153A
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还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω
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OH脂肪酸。所述CYP153A
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还原酶杂合融合多肽变体在以下位置中的任一处或多处具有突变，包括位置A796V，其中丙氨酸(A)被缬氨酸(V)取代(即，置换)；位置V141I，其中缬氨酸被异亮氨酸(I)取代；位置V141Q，其中缬氨酸(V)被谷氨酰胺(Q)取代；位置V141G，其中缬氨酸(V)被甘氨酸(G)取代；位置V141M，其中缬氨酸(V)被甲硫氨酸(M)取代；位置V141L，其中缬氨酸(V)被亮氨酸(L)取代；位置V141T，其中缬氨酸(V)被苏氨酸(T)取代；位置A231T，其中丙氨酸(A)被苏氨酸(T)取代；位置R27L，其中精氨酸(R)被赖氨酸(L)取代；位置R82D，其中精氨酸(R)被天冬氨酸(D)取代；位置R178N，其中精氨酸(R)被天冬酰胺(N)取代；位置N309R，其中天冬酰胺(N)被精氨酸(R)取代；位置N407A，其中天冬酰胺(N)被丙氨酸(A)取代；位置本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CYP153A
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还原酶杂合融合多肽变体，其与SEQ ID NO:38具有至少90％序列同一性并且在选自由27、56、111、140、149、154、157、162、164、204、244、254、271、273、302、309、407、477、480、481、527、544、546、557、567、591、648、649、706、707、708、709、710、719、720、736和741组成的组的氨基酸位置处具有至少一个突变，其中所述CYP153A
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还原酶杂合融合多肽变体催化脂肪酸转化为ω
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羟基化脂肪酸。2.根据权利要求1所述的CYP153A
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还原酶杂合融合多肽变体，其中所述突变选自由R27L、P56Q、F111A、S140N、P149G、P149R、V154G、S157R、V162C、A164N、G204V、A244R、R254G、E271D、P273M、T302M、N309S、N407G、P477G、I480G、G481I、D527E、D544N、P546G、E557W、E557R、E557R、E567S、E591Q、V648L、S649I、L706E、L706S、L706H、D707E、P708S、D709L、V710R、V710Q、V710C、R719W、D720V、A736V和N741G组成的组。3.一种重组宿主细胞，其包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：基因组股份公司，
类型：发明
国别省市：