筛选原代人类细胞中的同源T细胞和表位反应性的高通量方法技术

描述了一种自体同源的原代免疫细胞的测定法，其中可在没有HLA单倍型特异性试剂的情况下同时针对感兴趣的个别抗原，例如T细胞表位，对个体自身的血细胞进行功能性筛选。使用寡核苷酸标记的散列跟踪系统，随后通过单细胞测序进行去卷积，将抗原反应性与个别T细胞相关联。关联。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】筛选原代人类细胞中的同源T细胞和表位反应性的高通量方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据35U.S.C.
§
119(e)要求2019年10月3日提交的美国临时专利申请序列号62/910,379的优先权，其公开内容以引用的方式整体并入本文中。
[0003]对经由EFS WEB以文本文件提交的序列表的引用
[0004]文件10669_ST25.txt中编写的序列表为5千字节，创建于2020年10月2日，特此以引用的方式并入。

技术介绍

[0005]随着对人类疾病中抗原特异性T细胞活性的兴趣日益受到关注，需要能够将表位特异性TCR序列与HLA的环境中呈递的同源表位相关联。然而，鉴定哪些表位会导致生产性T细胞激活以及响应T细胞的TCR序列在历史上一直是并将继续是一项技术上具有挑战性的任务。
[0006]用于评估抗原特异性T细胞结合和反应性的传统方法包括多聚体染色和功能性T细胞测定，其中T细胞重新暴露于要通过细胞因子或细胞溶解反应(例如，ELISPOT、细胞杀伤测定)检测的表位。虽然这些方法很有用，但它们可能需要昂贵的个别HLA单倍型特异性试剂(多聚体)和大量血液来高通量评估潜在的反应性。此外，很少有HLA II类(CD4+T细胞)多聚体存在，因此大多数基于多聚体的研究都集中在HLA I类(CD8+T细胞)反应性上。
[0007]因此，尤其需要一种能够提供将TCR的同源TCRα和β多肽与TCR识别的表位相关联的信息的高通量方法。

技术实现思路

[0008]本文描述了一种免疫细胞测定法，其可用于自体同源和原代免疫细胞，其中可同时测定针对多个感兴趣的T细胞表位的CD8+T细胞和/或CD4+T细胞反应。使用散列标签寡核苷酸(HTO)跟踪系统将抗原反应性与个别T细胞相关联，随后可通过单细胞测序对其进行去卷积以提供单细胞水平信息，例如：(a)表位特异性，(b)单细胞配对α/β链TCR序列，(c)内源性单细胞RNA转录组信息，(d)细胞表面蛋白表达(例如，使用CITE
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seq抗体)，(e)多聚体染色(如果包括多聚体)，以及它们的任何组合。因此，本文提供了免疫细胞测定方法、用于所述方法的组合物和试剂盒，以及它们例如用于制备TCR治疗剂的用途。
[0009]在一个实施方案中，本文所述的方法包括例如基于激活诱导标志物(AIM)的表达从包含其它细胞，例如自体同源的抗原呈递细胞(APC)的组合物中分选激活T细胞，其中所述激活T细胞用HTO缀合的分子标记。
[0010]在一些实施方案中，本文所述的方法(例如，用于鉴定能够激活T细胞的抗原，以及任选地特异性结合所述抗原的TCR的T细胞受体(TCR)α链序列和/或TCRβ链序列)包括
[0011](I)基于激活诱导标志物(AIM)的表达从包含独特生物样品的组合物中分选激活T细胞，所述独特生物样品包含：(a)T细胞和表面结合的主要组织相容性复合体(MHC)，其中T
细胞能够识别在表面结合的MHC的环境中呈递的肽；(b)独特抗原；(c)独特散列标签寡核苷酸(HTO)，其可用于特异性鉴定(和/或特异性鉴定)独特抗原，其中独特HTO与用独特HTO标记T细胞的分子缀合，以及任选地，(d)支持T细胞的激活的培养基，以及
[0012](II)对(I)中分选的激活T细胞进行单细胞测序分析以鉴定与用独特HTO标记激活T细胞的分子缀合的独特HTO，其中鉴定独特HTO鉴定能够将激活T细胞激活的抗原，并且任选地其中单细胞测序分析还鉴定(i)由激活T细胞表达的一种或多种基因，和/或(ii)由激活T细胞表达的TCR的TCRα和/或β链序列。
[0013]本文所述的一些方法还包括在分选步骤之前建立多个生物样品，例如独特生物样品，使得分选的组合物包含多个独特生物样品。一些方法实施方案包括在分选之前通过将包含从受试者分离的T细胞和抗原呈递细胞(APC)的细胞集合平均分布到个别样品中来建立多个生物样品的步骤，其中每个生物样品任选地包含支持T细胞和/或APC活力、激活和/或活性的培养基和细胞因子。
[0014]一些方法实施方案包括在分选之前通过向多个生物样品中的每一个递送独特抗原和/或可用于特异性鉴定(和/或特异性鉴定)独特抗原的独特HTO来建立多个独特生物样品的步骤，其中独特HTO与用独特HTO标记T细胞的分子缀合，其中所述多个生物样品中的每一个包括包含从受试者分离的T细胞和APC的细胞集合，其中在递送独特抗原和/或与用独特HTO标记T细胞的分子缀合的独特HTO后，多个生物样品中的每一个变成独特生物样品，所述独特生物样品包含：(a)包含从受试者分离的T细胞和APC的细胞集合；(b)独特抗原；(c)特异性鉴定独特抗原并与用HTO标记T细胞的分子缀合的独特HTO，以及任选地(d)支持T细胞和APC的活力、活性和/或激活的培养基。任选地，可在本文中所述的方法中分选之前汇集多个独特生物样品，使得在(I)中分选的组合物包含多个独特生物样品。本文中的一些方法实施方案包括在分选步骤之前建立多个生物样品和建立(例如，从多个生物样品)多个独特生物样品，以及任选地汇集多个独特生物样品以建立可根据本文所述的方法分选的组合物的两个步骤。
[0015]在本文所述的一些方法中，分选包括基于AIM的表达对激活T细胞进行荧光激活细胞分选，例如，其中荧光激活细胞分选是基于用特异性结合AIM的荧光标记抗体检测表达AIM的T细胞。这类方法还可包括将独特生物样品(或包含一个或多个独特生物样品的组合物)与特异性结合AIM的荧光标记配体(例如，荧光标记抗体)一起孵育。
[0016]在一些实施方案中，本文所述的方法还包括对通过单细胞测序分析的激活T细胞进行功能和/或表型分析。在一些实施方案中，在单细胞测序分析之前进行功能和/或表型分析。在一些实施方案中，功能和/或表型分析与单细胞测序分析同时进行。在一些实施方案中，在单细胞测序分析之后进行功能和/或表型分析。在一些实施方案中，在单细胞测序分析之前、与单细胞测序分析同时和/或在单细胞测序分析之后进行功能和/或表型分析。在一些实施方案中，功能和/或表型分析包含流式细胞术分析。在一些实施方案中，功能和/或表型分析包含CITE
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seq分析。在一些实施方案中，功能和/或表型分析包含多聚体分析。在一些实施方案中，功能和/或表型分析包含流式细胞术分析、CITE
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seq分析和多聚体分析的任何组合。在一些实施方案中，进一步的功能和/或表型分析测量以下一种或多种的蛋白质和/或RNA表达水平：CD3、CD4、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、CD62L、HLA DR、CD137/4
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1BB、CD69、CD278、CD274、CD279、CD127、CD197、IFNγ、GZMH、GNLY、CD38、CCL3和LAG3。
[0017]在一些实施方案中，本文所述的方法包括鉴定特异性结合抗原的TCR的TCRα链序列和/或TCRβ链序列，优选地其本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于鉴定能够激活T细胞的抗原，以及任选地特异性结合所述抗原的TCR的T细胞受体(TCR)α链序列和/或TCRβ链序列的方法，所述方法包括：(I)基于激活诱导标志物(AIM)的表达从包含独特生物样品的组合物中分选激活T细胞，所述独特生物样品包含：(a)T细胞和表面结合的主要组织相容性复合体(MHC)，其中所述T细胞能够识别在所述表面结合的MHC的环境中呈递的肽，(b)独特抗原，(c)独特散列标签寡核苷酸(HTO)，其用于特异性鉴定所述独特抗原，其中所述独特HTO与用所述独特HTO标记所述T细胞的分子缀合，以及任选地，(d)支持所述T细胞的激活的培养基，以及(II)对(I)中分选的所述激活T细胞进行单细胞测序分析，以鉴定与用所述独特HTO标记所述激活T细胞的所述分子缀合的所述独特HTO，其中鉴定所述独特HTO鉴定能够激活所述激活T细胞的所述抗原，并且任选地其中所述单细胞测序分析还鉴定以下一种或多种：(i)由所述激活T细胞表达的一种或多种基因，和/或(ii)由所述激活T细胞表达的TCR的TCRα和/或β链序列。2.如权利要求1所述的方法，所述方法包括在分选之前进行以下步骤中的一个或两个：通过将包含从受试者分离的T细胞和抗原呈递细胞(APC)的细胞集合平均分布到个别样品中来建立多个生物样品，其中每个生物样品任选地包含支持T细胞和/或APC活力、激活和/或活性的培养基和细胞因子，以及通过向多个生物样品中的每一个递送独特抗原和/或用于特异性鉴定所述独特抗原的独特HTO来建立多个独特生物样品，其中所述独特HTO与用所述独特HTO标记T细胞的分子缀合，其中所述多个生物样品中的每一个包括包含从受试者分离的T细胞和APC的细胞集合，和任选地支持所述T细胞和APC的活力、活性和/或激活的培养基，并且其中在递送所述独特抗原和/或与用所述独特HTO标记T细胞的分子缀合的所述独特HTO后，所述多个生物样品中的每一个变成独特生物样品，所述独特生物样品包含：(a)包含从受试者分离的T细胞和APC的细胞集合，(b)独特抗原，(c)独特HTO，其特异性鉴定所述独特抗原并与用所述HTO标记所述T细胞的分子缀合，以及任选地(d)支持所述T细胞和APC的活力、活性和/或激活的培养基，使得(I)中分选的所述组合物包含多个独特生物样品。3.如权利要求2所述的方法，其中所述APC包含单核细胞来源的树突状细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞或它们的组合。4.如权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中分选包括基于所述激活诱导标志物(AIM)的表达对激活T细胞进行荧光激活细胞分选。5.如权利要求4所述的方法，其中所述AIM选自由以下组成的组：CD137/4
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1BB、CD107、IFNγ、PD
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1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA
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DR、CX3CR1、TIM3、LAG3、TIGIT和它们的任何组合。
6.如权利要求4或权利要求5所述的方法，其中荧光激活细胞分选是基于用所述AIM的荧光标记抗体检测。7.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括对II中分析的所述激活T细胞进行进一步的功能和/或表型分析，任选地其中所述进一步的功能和/或表型分析选自由以下组成的组：流式细胞术分析、CITE
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seq分析、多聚体分析和它们的组合。8.如权利要求7所述的方法，其中所述进一步的功能和/或表型分析测量以下一种或多种的蛋白质和/或RNA表达水平：CD3、CD4、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、CD62L、HLA
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DR、CD137/4
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1BB、CD69、CD278、CD274、CD279、CD127、CD197、IFNγ、GZMH、GNLY、CD38、CCL3和LAG3。9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中外周血单核细胞提供所述T细胞和表面结合的MHC。10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中用所述独特HTO标记所述T细胞的所述分子包含结合细胞表面分子的抗体。11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述AIM是或包含CD137/4
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1BB。12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括鉴定特异性结合所述抗原的TCR的TCRα链序列和/或TCRβ链序列并且所述TCRα链序列和/或TCRβ链序列分别是TCRα链可变区序列和/或TCRβ链可变区序列。13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括鉴定特异性结合所述抗原的TCR的TCRα链序列和/或TCRβ链序列并且所述方法还包括利用所述TCRα链序列和/或TCRβ链序列制造治疗剂。14.一种组合物，所述组合物包含生物样品，所述生物样品包含：(a)T细胞和表面结合的主要组织相容性复合体(MHC)，其中所述T细胞能够识别在所述表面结合的MHC的环境中呈递的肽，(b)抗原，(c)散列标签寡核苷酸(HTO)，其特异性鉴定所述抗原，其中所述HTO与用所述HTO标记所述T细胞的分子缀合，以及任选地(d)支持所述T细胞的激活的培养基。15.如权利要求14所述的组合物，其中(a)所述MHC在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达，任选地其中：所述T细胞和所述APC是自体同源的，所述T细胞和所述APC各自从人类供体分离，和/或所述APC选自由以下组成的组：单核细胞来源的树突状细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞和它们的组合，(b)所述抗原(I)选自由以下组成的组：(i)细菌抗原或其部分，(ii)病毒抗原或其部分，(iii)过敏原或其部分，
(iv)肿瘤相关抗原或其部分，以及(v)它们的组合，和/或(II)包含(i)氨基酸序列，(ii)核苷酸序列，(iii)溶解产物，以及(iv)它们的组合，(c)...

【专利技术属性】
技术研发人员：迪林，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：