一种核酸检测的曲线建立方法、检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种核酸检测的曲线建立方法、检测方法及通过该方法实现核酸快速检测的试剂盒，本发明专利技术的曲线建立方法结合磁球分离与时间分辨荧光检测技术，充分利用磁球可快速分离和富集痕量核酸，通过后续的杂交链式反应，大幅提高磁球表面特异性吸附的时间分辨荧光探针的浓度，从而放大荧光信号，建立核酸浓度

【技术实现步骤摘要】
一种核酸检测的曲线建立方法、检测方法及其试剂盒


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，特别涉及一种核酸检测的曲线建立方法、检测方法及其试剂盒。

技术介绍

[0002]核酸检测在疾病诊断，病源微生物、病毒的检测领域具有极其重要的作用。核酸检测就是对致病微生物的DNA或RNA的序列进行分析，然后通过分析结果来确诊病情。通过核酸检测就能知道是否存在病毒感染的情况，有助于及时发现病情。目前新冠病毒感染就是通过核酸检测来进行诊断的，如果核酸检测结果呈现阳性，就可以判断感染了新冠病毒。
[0003]核酸检测需要使用分子生物学方法来实现。核酸检测使用的方法是PCR扩增，步骤比较多。目前为了提高核酸检测的灵敏度，一般采用结合荧光检测法的荧光定量PCR方法，虽然这种检测方法具有较高的检测灵敏度，但是只能在中心实验室开展，且检测时间长，无法在现场进行快速检测，且容易受到杂散光以及样本内自发荧光的干扰，检测灵敏度仍然有限。目前亟需一种能显著缩短检测时间、大幅度提高检测灵敏度和特异性的核酸检测方法，这在全球新冠病毒疫情肆虐的背景下具有极为重要的意义。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中的缺陷，本专利技术提出了一种利用时间分辨荧光的核酸快速检测方法及其试剂盒，通过设计可与目标待测物部分互补的两段捕获链，其中第一捕获链与磁球连接，第二捕获链可引发发卡结构时间分辨荧光探针结合，通过磁球可实现目标待测物从样本中分离，再利用替换链在较高温度时与捕获链有高于目标物的结合能力，将磁球及荧光探针替换下，通过测定溶液中的荧光信号，实现对目标物的高灵敏度高特异性快速检测。
[0005]本专利技术提供一种核酸检测的曲线建立方法，包括如下步骤：
[0006]S1：设计第一捕获链、第二捕获链和替换链的序列，所述第一捕获链、第二捕获链均能与目标核酸序列互补配对，替换链可代替目标核酸与第一捕获链、第二捕获链互补配对。替换链在较高温度时与第一捕获链、第二捕获链具有更好的互补配对能力，所以可替换目标核酸序列；
[0007]S2：获得修饰有第一捕获链的磁球分散液；
[0008]S3：向步骤S2的修饰有第一捕获链的磁球分散液中加入第二捕获链和一系列不同浓度的目标核酸，混合反应，第一捕获链和第二捕获链结合在目标核酸的不同部位，实现磁球对目标核酸的完全捕获；
[0009]S4：加入时间分辨荧光发卡核酸探针，第二捕获链与所述时间分辨荧光发卡核酸探针发生链式杂交反应；
[0010]S5：加入替换链，混合反应，把磁球和时间分辨荧光发卡核酸探针替换下；
[0011]S6：吸附磁球，回收剩余的溶液部分；
[0012]S7：检测S6溶液部分的时间分辨荧光强度，建立核酸浓度
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荧光强度工作曲线。
[0013]本专利技术还提供一种使用所述曲线建立方法所获得的核酸浓度
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荧光强度工作曲线来进行核酸快速检测的方法，包括如下步骤：
[0014]S1：获得修饰有第一捕获链的磁球溶液，所述第一捕获链能够与目标核酸序列互补配对；
[0015]S2：向步骤S1的修饰有第一捕获链的磁球溶液中加入第二捕获链和待测目标物，混合反应，第一捕获链和第二捕获链结合在待测目标物的核酸的不同部位，实现磁球对目标核酸的完全捕获；
[0016]S3：加入时间分辨荧光发卡核酸探针，第二捕获链与所述时间分辨荧光发卡核酸探针发生链式杂交反应；
[0017]S4：加入替换链，混合反应，把磁球和时间分辨荧光发卡核酸探针替换下；
[0018]S5：吸附磁球，回收剩余的溶液部分；
[0019]S6：检测S5溶液部分的时间分辨荧光强度，根据所获得的核酸浓度
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荧光强度工作曲线计算出待测目标物的核酸浓度。
[0020]进一步的，所述步骤S1中所述磁球和所述第一捕获链的摩尔比为1:1
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1:30。
[0021]进一步的，所述步骤S1中所述磁球和所述第一捕获链的摩尔比为1:8。这个比值是最优的，比值太低偶联效率低，比值太高会造成成本升高和浪费。
[0022]进一步的，所述步骤S2中所述第二捕获链的终浓度为10
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100nM，所述步骤S3中所述时间分辨荧光发卡核酸探针的终浓度为10
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100nM，所述步骤S4中所述替换链的终浓度为10
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100nM。
[0023]进一步的，所述步骤S2中所述第二捕获链的终浓度为50nM，所述步骤S3中所述时间分辨荧光发卡核酸探针的终浓度为50nM，所述步骤S4中所述替换链的终浓度为50nM，时间分辨荧光发卡核酸探针是绝对过量的，但是浓度过高会导致后续步骤中很难洗掉未结合的探针，浓度过低不能有效放大信号，故所述第二捕获链、时间分辨荧光发卡核酸探针和替换链的终浓度都是实验验证的最优选择。
[0024]进一步的，所述步骤S3中所述时间分辨荧光发卡核酸探针的荧光基团为镧系螯合物长寿命荧光染料。
[0025]进一步的，所述步骤S3中所述时间分辨荧光发卡核酸探针的荧光基团为铽离子的配合物，所述铽离子的配合物为L4Tb，所述L4Tb中的铽离子与配体结合，所述配体的结构式为：
[0026]普通的铽(Tb)材料，没有做络合物保护，光强很弱且稳定性较差，L4Tb荧光基团中的Tb有所述结构式的配体保护，Tb与所述结构式的配体结合，更加稳定，故使用L4Tb作为荧光基团可以提高荧光强度并且增强光稳定性。
[0027]进一步的，所述步骤S4的反应温度高于步骤S2的反应温度。
[0028]本专利技术还提供一种核酸快速检测试剂盒，其特征在于，包括以下成份：磁球、第一捕获链、第二捕获链、替换链、时间分辨荧光发卡核酸探针和缓冲液，所述第一捕获链、第二捕获链和替换链均与目标核酸序列互补配对，所述第二捕获链与所述时间分辨荧光发卡核酸探针发生链式杂交反应，替换链可代替目标核酸与第一捕获链、第二捕获链互补配对。
[0029]进一步的，所述时间分辨荧光发卡核酸探针的荧光基团为镧系螯合物长寿命荧光染料。
[0030]本专利技术还提供所述的检测试剂盒在新型冠状病毒核酸检测上的应用。
[0031]进一步的，所述第一捕获链的序列为：CATCAGGAGATGC。
[0032]进一步的，所述第二捕获链的序列为：CTGGATGATGATGAGATGAGAATGCCACGTACAGGTGGAACCT。
[0033]进一步的，所述替换链的序列为：CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC。
[0034]综上，与现有技术相比，本专利技术达到了以下技术效果：
[0035]1.本专利技术利用结合磁球的快速富集和高效分离能力直接捕获样本内的目标核酸片段，并通过杂交链反应放大荧光信号达到高灵敏度检测。
[0036]2.本专利技术的方法可以显著缩短核酸检测的时间，普通核酸检测方法至少需要4小时，而本专利技术的流程可以缩短到1小时以内。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸检测的曲线建立方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：设计第一捕获链、第二捕获链和替换链的序列，所述第一捕获链、第二捕获链均能与目标核酸序列部分互补配对，替换链可代替目标核酸与第一捕获链、第二捕获链互补配对；S2：获得修饰有第一捕获链的磁球分散液；S3：向步骤S2的修饰有第一捕获链的磁球分散液中加入第二捕获链和一系列不同浓度的目标核酸，混合反应，第一捕获链和第二捕获链结合在目标核酸的不同部位，实现磁球对目标核酸的完全捕获；S4：加入时间分辨荧光发卡核酸探针，第二捕获链与所述时间分辨荧光发卡核酸探针发生链式杂交反应；S5：加入替换链，混合反应，把磁球和时间分辨荧光发卡核酸探针替换下；S6：吸附磁球，回收剩余的溶液部分；S7：检测S6溶液部分的时间分辨荧光强度，建立核酸浓度
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荧光强度工作曲线。2.一种使用权利要求1所述的曲线建立方法所获得的核酸浓度
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荧光强度工作曲线来进行核酸快速检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：获得修饰有第一捕获链的磁球溶液，所述第一捕获链能够与目标核酸序列互补配对；S2：向步骤S1的修饰有第一捕获链的磁球溶液中加入第二捕获链和待测目标物，混合反应，第一捕获链和第二捕获链结合在待测目标物的核酸的不同部位，实现磁球对目标核酸的完全捕获；S3：加入时间分辨荧光发卡核酸探针，第二捕获链与所述时间分辨荧光发卡核酸探针发生链式杂交反应；S4：加入替换链，混合反应，把磁球和时间分辨荧光发卡核酸探针替换下；S5：吸附磁球，回收剩余的溶液部分；S6：检测S5溶液部分的时间分辨荧光强度，根据权利要求1所获得的核酸浓度
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荧光强度工作曲线计算出待测目标物的核酸浓度。3.根据权利要求2所述的核酸快速检测的方法，其特征在于，所述步骤S1中所述磁球和所述第一捕获链的摩尔比为1:1
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1:30。4.根据权利要求3所述的核酸快速检测的方法，其特征在于，所述步骤S1中所述磁球和所述第一捕获链的摩尔比为1:8。5.根据权利要求2所述的核酸快速检测的方法，其特征在于，所述步骤S2中所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：金宗文，罗擎颖，刘翠，卫小元，
申请(专利权)人：鲁米博公司，
类型：发明
国别省市：