提取H因子的方法技术

本发明专利技术提出了提取H因子的方法，所述方法包括：步骤1：将含有H因子的血浆级分沉淀溶解于提取液中，得到含有H因子的溶解液；步骤2：将所述含有H因子的溶解液与C7～C9短链脂肪酸和/或其衍生物混合，得到固液混合物；步骤3：将所述固液混合物进行固液分离，收集上清液，得到含有H因子的初提液。利用本发明专利技术的提取H因子方法可以高效提取分离H因子，H因子收率高、纯度高，操作简便、用时短，有利于提高血浆的综合利用率，适于产业化生产应用。适于产业化生产应用。

【技术实现步骤摘要】
提取H因子的方法


[0001]本专利技术涉及生物领域。具体地，本专利技术涉及提取H因子的方法。

技术介绍

[0002]H因子是155kDa的可溶性糖蛋白，在调节补体替代途径中起重要作用，防止补体系统对宿主组织的非特异性损伤。H因子属于微量蛋白，血浆中的浓度仅为110
‑
615μg/mL。迄今为止，都没有H因子产品上市，其中一个原因为H因子含量甚微，现有的纯化工艺回收率低，难以实现产业化生产。另一方面，血浆中主要的血浆蛋白制品为人免疫球蛋白、人血白蛋白、纤维蛋白原、凝血酶原复合物等。由于血浆来源的限制，血液制品一直处于供不应求的局面，从血浆中分离更多的血浆蛋白一直是热门研究方向。如何在不降低主要的血浆蛋白制品收率的情况下，分离得到足以满足产业化生产的H因子的问题更加难以解决。
[0003]辛酸是一种天然存在的含有8个碳的短链脂肪酸。长期以来，辛酸及其衍生物常用作白蛋白稳定剂、非免疫球蛋白级分沉淀剂和杀菌剂。辛酸对各种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及真菌具有抑制作用。目前，有研究报道了辛酸在获取血浆中免疫球蛋白的应用，具体为辛酸加入血浆中可产生沉淀，上清液中含有免疫球蛋白，以实现分离提取免疫球蛋白的目的，而沉淀中含有杂蛋白以及H因子。
[0004]目前，有研究报道血液或血浆组分添加辛酸盐可以沉淀H因子，辛酸沉淀物溶解于缓冲液后，取上清液进行S/D病毒灭活，然后进行阳离子交换层析，进而富集H因子。但是，辛酸沉淀物需要多次溶解和过滤，此过程中沉淀无法完全溶解，并且溶解和过滤过程中所弃去的滤液和滤饼中难以避免地会残留H因子。因此上述方法中的多次溶解和过滤操作会导致H因子这一微量蛋白大量损失、回收率降低，难以产业化生产。
[0005]因此，目前由血浆中提取H因子的方法仍有待研究。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。为此，本专利技术提出了提取H因子的方法、H因子中间品、提取血浆蛋白的方法和血浆蛋白制品，利用该提取H因子的方法可以高效提取分离H因子，H因子收率高、纯度高，操作简便、用时短，利用该提取血浆蛋白的方法所得血浆蛋白含量收率高、纯度高，适于产业化生产应用。
[0007]在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种提取H因子的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：步骤1：将含有H因子的血浆级分沉淀溶解于提取液中，得到含有H因子的溶解液；步骤2：将所述含有H因子的溶解液与C7～C9短链脂肪酸和/或其衍生物混合，得到固液混合物；步骤3：将所述固液混合物进行固液分离，收集上清液，得到含有H因子的初提液。如前所述，目前现有技术主要是将血浆中的H因子完全沉淀出来，然后溶解，从而达到提取目的。但是，这种方法收率低，难以实现工业化生产。进而，专利技术人尝试尽可能地使非H因子沉淀，而大部分H因子保留在上清液中，从而提高H因子收率。
[0008]现有技术都是采用辛酸、PEG等蛋白沉淀剂来沉淀H因子，然后再溶解的方式来获
得H因子的初提液。但是该方法需要多次溶解和过滤步骤，由于无法使辛酸沉淀物中的H因子完全溶解出来以及过滤造成损失，使H因子的回收率很低，难以实现产业化生产。为此，专利技术人尝试简化操作步骤，开发一种从血浆级分沉淀开始仅需一次溶解和过滤就能实现H因子初步纯化的方法，提高H因子的回收率。与现有技术的思路相反，专利技术人考虑将血浆级分沉淀溶解后采用辛酸来沉淀非H因子蛋白而不是沉淀H因子，保留H因子在上清液，这就能省去H因子沉淀后再溶解的步骤，只需一步溶解和过滤，即可得到H因子的初提液。
[0009]根据本专利技术的实施例，上述提取H因子的方法还可以具有下列附加技术特征：
[0010]根据本专利技术的实施例，根据本专利技术的实施例，所述提取液的pH值为4.0～5.0。
[0011]根据本专利技术的实施例，所述C7～C9短链脂肪酸和/或其衍生物选自C7～C9脂肪酸、C7～C9脂肪酸盐或C7～C9脂肪酸酯。
[0012]根据本专利技术的实施例，所述C7～C9短链脂肪酸和/或其衍生物的终浓度为不超过10mM。
[0013]根据本专利技术的实施例，所述C7～C9短链脂肪酸和/或其衍生物的终浓度为不超过5mM。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述提取液为包含蛋白酶抑制剂的缓冲液。
[0015]根据本专利技术的实施例，所述蛋白酶抑制剂选自下列至少之一：EDTA或其盐、乙二醇四乙酸、苯甲酰胺、苯甲酰胺盐酸盐或其衍生物、赖氨酸或其衍生物、6
‑
氨基己酸或其衍生物、反式
‑4‑
(氨甲基)环己酸或其衍生物、4
‑
(2
‑
氨基乙基)苯磺酰氟或其衍生物、(4
‑
酰胺基
‑
苯基)
‑
甲烷磺酰氟或其衍生物、3,4
‑
二氯异香豆素或其衍生物、亮抑酶肽或其衍生物、抑肽酶或其衍生物。
[0016]根据本专利技术的实施例，所述缓冲液中的缓冲剂选自乙酸盐、柠檬酸盐、Tris
‑
HCl和磷酸盐的至少之一。
[0017]根据本专利技术的实施例，所述提取液包含20～100mM柠檬酸钠、150～320mM氯化钠和5～16mM EDTA或其钠盐。
[0018]根据本专利技术的实施例，所述含有H因子的溶解液的电导率为25～30ms/cm。
[0019]根据本专利技术的实施例，所述含有H因子的血浆级分沉淀的总质量与所述提取液的质量比为1：(2～20)。
[0020]根据本专利技术的实施例，所述含有H因子的血浆级分沉淀为FI+III沉淀。
[0021]根据本专利技术的实施例，步骤1和步骤2均是在搅拌状态下进行的，搅拌的转速为150～600rpm。
[0022]根据本专利技术的实施例，步骤1中，所述溶解的温度为0～20℃，时间为1～5小时；步骤2中，所述混合的时间为1～5小时。
[0023]根据本专利技术的实施例，所述方法进一步包括：在pH3.8～4.5和35～40℃条件下，孵育步骤3中所述含有H因子的初提液。
[0024]在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种H因子中间品。根据本专利技术的实施例，所述H因子中间品是通过前面所述提取H因子的方法所获得的。由此，根据本专利技术实施例的H因子中间品收率高。
[0025]在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种提取血浆蛋白的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：实施前面所述提取H因子的方法中的步骤1和步骤2，得到固液混合物；
将所述固液混合物进行过滤或离心，收集沉淀，得到含有血浆蛋白的沉淀物；以及任选的将所述含有血浆蛋白的沉淀物进行纯化处理。由此，利用根据本专利技术实施例的方法所得血浆蛋白含量收率高、纯度高，适于产业化生产应用。
[0026]在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种血浆蛋白制品中间品。根据本专利技术的实施例，所述血浆蛋白制品中间品是通过前面所述提取血浆蛋白的方法所得到的。由此，根据本专利技术实施例的血浆蛋白制品中血浆蛋白纯度高。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提取H因子的方法，其特征在于，包括：步骤1：将含有H因子的血浆级分沉淀溶解于提取液中，得到含有H因子的溶解液；步骤2：将所述含有H因子的溶解液与C7～C9短链脂肪酸和/或其衍生物混合，得到固液混合物；步骤3：将所述固液混合物进行固液分离，收集上清液，得到含有H因子的初提液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取液的pH值为4.0～5.0；任选地，所述C7～C9短链脂肪酸和/或其衍生物选自C7～C9脂肪酸、C7～C9脂肪酸盐或C7～C9脂肪酸酯。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述C7～C9短链脂肪酸和/或其衍生物的终浓度为不超过10mM；任选地，所述C7～C9短链脂肪酸和/或其衍生物的终浓度为不超过5mM。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取液为包含蛋白酶抑制剂的缓冲液；任选地，所述蛋白酶抑制剂选自下列至少之一：EDTA或其盐、乙二醇四乙酸、苯甲酰胺、苯甲酰胺盐酸盐或其衍生物、赖氨酸或其衍生物、6
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氨基己酸或其衍生物、反式
‑4‑
(氨甲基)环己酸或其衍生物、4
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(2
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氨基乙基)苯磺酰氟或其衍生物、(4
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酰胺基
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苯基)
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甲烷磺酰氟或其衍生物、3,4
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二氯异香豆素或其衍生物、亮抑酶肽或其衍生物、抑肽酶或其衍生物；任选地，所述缓冲液中的缓冲剂选自乙酸盐、柠檬酸盐、Tris
‑
HCl和磷酸盐的至少之一；任选地，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘刚，王凯，王强，高玲，蒋德席，
申请(专利权)人：四川远大蜀阳药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：