FAR1基因的新用途制造技术

本发明专利技术公开了FAR1基因的新用途，即以抑制FAR1基因表达为目的的筛选用于治疗非小细胞肺癌药物的应用，本发明专利技术通过CRISPR/Cas9技术构建FAR1基因敲除质粒，进一步构建A549

【技术实现步骤摘要】
FAR1基因的新用途


[0001]本专利技术属于医药
，具体涉及FAR1基因的新用途。

技术介绍

[0002]非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌总数超过 80%，与吸烟习惯、环境污染密切相关。肺癌是癌症病症头号杀手，每年全球都有超过一百万的病人因此丧生。肺癌发生率和死亡率互相紧密联系，尽管诊断技术和治疗方法在不断改进创新，但肺癌的总体 5年生存率依旧很低，全球形势不容乐观。肿瘤发病机制复杂多变，肿瘤的靶向治疗在诊断及治疗 NSCLC中始终占据关键地位。因此，深入探究肺癌细胞信号传导网络，研究可靠的治疗靶点是治疗NSCLC的一个重要途径。
[0003]MAPK信号通路的异常表达和过度激活是导致癌症发生发展的重要通路，已经有许多靶向MAPK信号通路的药物进行临床试验，并且有部分药物，如靶向B
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Raf的抑制剂Dabrafenib以及靶向MEK的抑制剂Trametinib已经被FDA批准在临床联合使用治疗NSCLC，不同于该通路上的其他“明星”蛋白，A
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Raf蛋白由于激酶活性较弱等原因，对其在抗肿瘤的研究较少，但是在肺腺癌患者中也发现了A
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RafS241C突变，因此通过研究A
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Raf结合蛋白，阐明他们之间的调控机制，可以为NSCLC的治疗提供新的靶点。RAF是细胞内信号通路MAPK上的枢纽蛋白，包括调控细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等很多生物学过程，这条信号通路的异常激活，造成细胞内生物学功能的紊乱，最终导致肿瘤的发生。
[0004]FAR1是一种过氧化物酶体膜蛋白，参与醚脂和甘油磷脂等脂质的合成，FAR1优先将C16和C18的磷脂酰辅酶A还原为脂肪醇，该步骤是醚脂合成的限速步骤，为有机体合成醚脂/缩醛磷脂、蜡单脂提供底物。醚脂和甘油磷脂等脂质参与调控细胞生物学功能及一系列信号转导，当细胞内的脂质稳态发生变化时会导致细胞癌变。已有研究指出，当小鼠暴露于PM
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的环境中时，体内甘油三酯、游离脂肪酸水平增加，并伴随缩醛磷脂紊乱，使肺部更容易引发肺炎，进一步促进肺癌的发生。但是对在癌症发展过程中FAR1蛋白在其中发挥的功能的相关研究却很少，其涉及的分子机制尚不明确，FAR1作为A
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Raf激酶的结合蛋白之一，可以成为FAR1蛋白功能研究的新方向。
[0005]靶向治疗是目前临床对NSCLC患者比较有效的治疗手段之一，通过靶向目的基因/蛋白，改变癌细胞内信号通路，阻止癌变的发展从而达到治疗效果，因此探索NSCLC的治疗靶点具有重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了FAR1基因的新用途，即以抑制FAR1基因表达为目的的筛选用于治疗非小细胞肺癌药物的应用，所述FAR1基因的核苷酸序列见genebank中基因登录号为ID：84188。
[0007]异常的脂质代谢是癌细胞的特征之一，特别是醚脂和磷脂在肿瘤中的变化，但是他们在癌症中的具体功能扔不清楚。FAR1蛋白作为缩醛磷脂合成途径的限速酶，为了深入
了解FAR1蛋白的功能和基质，首先要了解FAR1蛋白参与调控的脂质，因此利用CRISPR/Cas9技术敲除A549细胞中的FAR1基因通过代谢组学比较FAR1基因敲除的A549细胞与野生型A549细胞之间细胞内脂质含量的差异。通过比较差异脂质的归类分析，了解FAR1所参与的脂质代谢途径，有利于更加全面得了解FAR1蛋白的生物学功能。
[0008]本实验成功构建敲除FAR1基因的A549细胞株A549
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KO
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FAR1（AKF），通过非靶向脂质代谢组学分析，在正常肺泡上皮细胞（HPAEpic）和肺腺癌细胞（A549）之间共有97个差异脂质，其中C16和C18的脂质有47个，差异脂质主要类别为甘油三酯（TG）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）。通过非靶向脂质代谢组学分析发现，在A549
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KO
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FAR1（AKF）和野生型A549之间共有102个差异脂质，其中C16和C18的脂质有51个，差异脂质主要类别为甘油三酯（TG）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）。通过两两比较，发现敲除FAR1基因后，A549中部分TG和PC脂质水平得到恢复，并且qPCR的结果也证明了这一点，表明FAR1调控A549细胞中的脂质代谢。通过敲除A549细胞中的FAR1基因开展功能试验发现FAR1蛋白能够促进肺腺癌细胞增殖和迁移的能力，进而说明可以通过抑制FAR1蛋白表达来达到治疗非小细胞肺癌的目的，本专利技术为将来基于FAR1蛋白的非小细胞肺癌治疗药物的开发提供了可能，本专利技术具有较大的应用价值和前景。
附图说明
[0009]图1为Western blotting验证A549细胞稳定敲除FAR1单克隆细胞株结果示意图；图2为PX459
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FAR1基因敲除细胞系PCR扩增片段序列比对结果示意图；图3为正常肺泡上皮细胞、肺腺癌细胞A549和AKF 细胞的C16和C18差异脂质统计分析热图；图4为三种细胞C16和C18差异脂质分析柱状图；图5 为三种细胞C16和C18差异脂质分析柱状图；图6 为两组样品C16和C18差异脂质表达结果韦恩示意图；图7 为参与PC合成与代谢的蛋白的qPCR分析；图中*p<0.05,** p<0.01，*** p<0.001，**** p<0.0001，T
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Test；图8 为参与TG合成与代谢的蛋白的qPCR分析；图中*p<0.05,** p<0.01，*** p<0.001，**** p<0.0001，T
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Test；图9 为细胞增殖实验结果示意图，图中 *** p<0.001，T
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Test；图10 为细胞克隆形成实验结果，图中*p<0.05, T
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Test，其中上图为克隆培养结果，下图为统计数据；图11 为细胞划痕实验结果；图中*** p<0.001，T
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Test，其中上图为细胞划痕实验结果，下图为统计数据；图12 为细胞Transwell迁移实验结果； *** p<0.001，**** p<0.0001，T
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Test，其中上图为迁移实验结果，下图为统计数据；上述图例中AKF即为A549
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FAR1
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KO稳转细胞株，即稳定敲除FAR1的A549细胞株；RESCUE为在敲除FAR1的细胞中转入FAR1高表达质粒，属于恢复实验，作为对照组。
具体实施方式
[0010]下面通过实施例来进一步说明本专利技术的实质性内容，但本专利技术的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，所用试剂如无特殊说明，均为常规时售试剂或按常规方法配本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.以抑制FAR1基因表达为目的的筛选用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：王敏，郝佩琪，徐天瑞，安输，苏慧玲，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：