重组表达载体系统及其在构建干细胞定向诱导报告细胞中的应用技术方案

本申请公开一种重组表达载体系统，包括：目的基因的启动子、编码蛋白酶的第一基因元件、编码转录因子DNA结合结构域

【技术实现步骤摘要】
重组表达载体系统及其在构建干细胞定向诱导报告细胞中的应用


[0001]本申请涉及生物医药工程
，尤其涉及一种重组表达载体系统及其在构建干细胞定向诱导报告细胞中的应用。

技术介绍

[0002]干细胞是一类具有自我更新和多潜能细胞分化两个基本特性的细胞。干细胞的分化可归结为基因组中特定基因按一定顺序相继活化和表达的复杂生命过程。尽管这一过程是按遗传信息指令自然而然发生的，但基因表达的时间特异性和空间特异性、基因表达调控的多样性、基因表达受环境变化的诱导和阻遏、不同基因表达的协调调节、以及基因表达调控受顺式作用元件和反式作用因子共同调节等重要生物学事件的分子机制等尚未完全认识，给干细胞体外定向诱导分化和规模化培养的研究，以及临床治疗的应用研究带来不可克服性。由于干细胞的特殊生物学特性，人们期望干细胞的移植治疗应用于常规治疗效果较差的疾病，如肝病、白血病、糖尿病等，虽显示出巨大的应用前景。但目前仍亟待解决的问题是如何在体外规模化、定向诱导分化为特定方向的终末细胞。尽管已往的研究采用细胞/生长因子诱导法、转基因诱导法和细胞共培养法等取得了很多研究进展，但在细胞培养的过程中无法知晓细胞内发生了哪些生物学事件，获得规模化一致性的目的细胞仍是瓶颈问题。

技术实现思路

[0003]本申请的目的是，利用合成生物学技术为干细胞智能化的实现提供思路，具体是提供一种重组表达载体系统，并且该重组表达系统在构建干细胞定向诱导报告细胞中的应用。
[0004]为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：
[0005]第一方面，提供一种重组表达载体系统，包括：目的基因的启动子、编码蛋白酶的第一基因元件、编码转录因子DNA结合结构域
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第一分子接头融合蛋白的第二基因元件、编码第二分子接头
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转录因子转录活化结构域
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蛋白酶裂解位点
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降解决定子融合蛋白的第三基因元件和报告基因；所述目的基因的启动子分别驱动所述第一基因元件、所述第二基因元件和所述第三基因元件表达，表达产物构成驱动所述报告基因表达的转录活化效应物。
[0006]进一步地，所述重组表达载体采用真核表达载体。
[0007]可选择地，所述报告基因包括以下至少一种：Nluc、Gluc、Cluc、SEAP、Fluc、Rluc、GFP、mCherry、BFP、YFP。
[0008]可选择地，所述第一分子接头与第二分子接头对应匹配构成蛋白质二聚体或多肽二聚体。
[0009]进一步可选择地，所述第一分子接头与第二分子接头对应匹配构成亮氨酸拉链结构或抗原
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抗体复合物。
[0010]进一步地，所述转录因子转录活化结构域和转录因子DNA结合结构域对应匹配所述报告基因的启动子。
[0011]可选择地，所述报告基因的启动子采用合成启动子，包括以下启动子的组合：UAS、pminCMV、Teto7、ZFHD1RE、PIR、ZFHD1、ZF21
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16RE、ZF42
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10R、ZF43
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8RE、ZF54
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8RE、pSV40。
[0012]进一步可选择地，所述报告基因的启动子采用以下任意一种：UAS
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pminCMV、Teto7
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pminCMV、ZFHD1RE
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pminCMV、PIR
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pminCMV、ZFHD1
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pminCMV、ZF21
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16RE
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pminCMV、ZF42
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10R
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pminCMV、ZF43
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8RE
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pminCMV、ZF54
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8RE
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pminCMV、UAS
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pSV40、Teto7
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pSV40、ZFHD1RE
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pSV40、PIR
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pSV40、ZFHD1
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pSV40、ZF21
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16RE
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pSV40、ZF42
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10R
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pSV40、ZF43
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8RE
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pSV40、ZF54
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8RE
‑
pSV40。
[0013]进一步地，所述报告基因的启动子的拷贝数为4～8。
[0014]进一步地，所述蛋白酶裂解位点与所述蛋白酶对应匹配，使得所述蛋白酶作为所述报告基因表达的激活因子；所述第三基因元件含有编码所述蛋白酶裂解位点的氨基酸序列的区域。
[0015]可选择地，所述蛋白酶采用以下任意一种：李子痘病毒蛋白酶、烟草蚀刻病毒蛋白酶、南方豆花叶病毒蛋白酶、烟草脉动斑驳病毒蛋白酶。
[0016]可选择地，分别驱动所述第一基因元件、所述第二基因元件和所述第三基因元件表达的目的基因的启动子互不相同，或者，分别驱动所述第一基因元件、所述第二基因元件和所述第三基因元件表达的目的基因的启动子所对应的目的基因互不相同。
[0017]第二方面，前述的重组表达载体系统在构建报告细胞中的应用。
[0018]进一步地，利用至少一个表达载体构建所述重组表达载体系；将所述重组表达体系导入目标细胞中，形成所述报告细胞；监控所述报告细胞中的报告基因的表达产物。
[0019]第三方面，前述的重组表达载体系统在干细胞定向诱导分化中的应用。
[0020]可选择地，所述重组表达载体系统应用于干细胞定向诱导分化为肝细胞的监控。
[0021]进一步地，所述肝细胞的目标基因包括以下至少一种：ALB、CYP2C9、CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4。
[0022]可选择地，所述干细胞包括以下至少一种：间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞。
[0023]进一步可选择地，所述间充质干细胞包括以下至少一种：脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞、月经血间充质干细胞、羊膜间充质干细胞。
[0024]与现有技术相比较，本申请具有如下优势：
[0025](1)本申请基于基因回路原理，利用重组表达载体系统构建了由两个输入与门串联构成的三输入与门，通过串联两个逻辑门控，实现一个与门的输出信号作为另一个与门的输入信号，只有三个输入信号同时存在时，才能够检测到报告基因的输出信号，有利于实现多目的基因的监控；
[0026](2)本申请所限定的报告基因编码分泌型蛋白或荧光蛋白，能实现对报告基因的多次重复检测，提高监控的实时性，与检测报告基因的RT
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PCR结果相比较，本申请的检测方法更简易高效；
[0027](3)本申请应用于干细胞定向诱导分化的监控中，通过限定不同的目的基因及对
应的目的基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组表达载体系统，其特征在于，包括：目的基因的启动子、编码蛋白酶的第一基因元件、编码转录因子DNA结合结构域
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第一分子接头融合蛋白的第二基因元件、编码第二分子接头
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转录因子转录活化结构域
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蛋白酶裂解位点
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降解决定子融合蛋白的第三基因元件和报告基因；所述目的基因的启动子分别驱动所述第一基因元件、所述第二基因元件和所述第三基因元件表达，表达产物构成驱动所述报告基因表达的转录活化效应物。2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述重组表达载体采用真核表达载体。3.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述报告基因包括以下至少一种：Nluc、Gluc、Cluc、SEAP、Fluc、Rluc、GFP、mCherry、BFP、YFP。4.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述第一分子接头与第二分子接头对应匹配构成蛋白质二聚体或多肽二聚体。5.如权利要求4所述的系统，其特征在于，所述第一分子接头与第二分子接头对应匹配构成亮氨酸拉链结构或抗原
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抗体复合物。6.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述转录因子转录活化结构域和转录因子DNA结合结构域对应匹配所述报告基因的启动子。7.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述报告基因的启动子采用合成启动子，包括以下启动子的组合：UAS、pminCMV、Teto7、ZFHD1RE、PIR、ZFHD1、ZF21
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16RE、ZF42
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10R、ZF43
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8RE、ZF54
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8RE、pSV40。8.如权利要求7所述的系统，其特征在于，所述报告基因的启动子采用以下任意一种：UAS
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pminCMV、Teto7
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pminCMV、ZFHD1RE
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pminCMV、PIR
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pminCMV、ZFHD1
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pminCMV、ZF21
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16RE
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pminCMV、ZF42
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10R
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pminCMV、ZF43
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8RE
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pminCMV、ZF54
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8RE
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pmin...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭青，杨万人，高毅，周树勤，李阳，黎少，梁康檐，张莹，金美先，
申请(专利权)人：南方医科大学珠江医院，
类型：发明
国别省市：